HSP70蛋白在神经元样PC12细胞氧糖剥夺后的表达变化

何金婷 莽 靖 胥桂华 杨 乐 王姣琦 包晓群 徐忠信

(吉林大学中日联谊医院神经内一科，吉林 长春 130033)

HSP70蛋白在神经元样PC12细胞氧糖剥夺后的表达变化

何金婷 莽 靖 胥桂华 杨 乐1王姣琦 包晓群 徐忠信

(吉林大学中日联谊医院神经内一科，吉林 长春 130033)

目的探讨神经细胞氧糖剥夺(OGD)造模后PC12细胞凋亡和热休克蛋白(HSP)70水平，评价OGD模型。方法利用PC12细胞，经NGF刺激诱导向神经细胞分化，利用OGD建立神经细胞OGD模型;利用MTT法、共聚焦显微镜鉴定PC12细胞转化为神经元样细胞及OGD模型的建立，Western印迹检测OGD后HSP70蛋白的表达。结果应用终浓度50 ng/ml NGF的DMEM完全培养基培养PC12细胞，随培养时间的增加细胞呈典型的神经元形态。微管相关蛋白(MAP)2免疫荧光细胞化学染色呈强阳性;建立OGD后神经元出现不同程度的损伤、坏死及凋亡，随OGD时间延长存活率逐渐降低、凋亡率升高、HSP70蛋白表达增加。结论NGF有效地诱导PC12细胞转化为神经细胞，OGD可以有效诱导HSP70表达。

PC12细胞;氧糖剥夺;HSP70蛋白

缺血性脑损伤相关信号转导机制一直受到广泛关注〔1〕，在缺血性脑损伤研究中需建立可模拟脑缺血损伤的体外细胞模型。本实验采用神经细胞株PC12细胞以神经细胞生长因子(NGF)诱导分化为神经样细胞，进行氧糖剥夺(OGD)建立稳定神经细胞缺血缺氧模型，为进一步研究缺血性脑损伤相关信号转导机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞株购自北京金紫晶生物医药技术有限公司。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基:美国Gibco公司生产。胎牛血清:北京鼎国公司生产。胰蛋白酶、噻唑蓝、二甲基亚砜(DMSO)、鼠 NGF均为美国 Sigma生产。抗热休克蛋白70(HSP70)抗体购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 Model550酶联分析仪:美国BIO-RAD。医用净化工作台;苏州净化设备公司。激光共聚焦显微镜:日本OLYMPUS。

1.2 方法

1.2.1 PC12细胞培养和微管相关蛋白2(MAP2)染色共聚焦显微镜观察 PC12细胞在10%胎牛血清的DMEM培养液(100 U/ml青霉素、100 U/m l链霉素)中，37℃ 5%CO2培养至细胞汇集80%，应用含NGF培养液培养6 d，观察细胞生长情况。从24孔板中取出细胞爬片，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，4%甲醛固定15 min，0.1%Triton X-100通透10 min，预冷PBS洗涤3次，10%羊血清封闭30 min，吸取上清;加入一抗兔抗鼠MAP2 200μl(1∶500)，4℃过夜，预冷 PBS洗涤 3次，5 min/次;加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG二抗，使用防淬灭封片剂封片;使用激光共聚焦显微镜采集〔2〕。

1.2.2 PC12细胞OGD模型的建立 将直径300 mm的真空干燥的玻璃塞塞入双管橡皮塞，作为进出气口。内侧端的乳胶管为出气管(缸底液平以上)，另一根玻璃管外侧端为进气管(气相连)。在缺氧罐内注入约50 m l的无菌双蒸水、40 g连二亚硫酸钠，缺氧罐进气管与气瓶相连，打开气瓶阀门，气体流量为300 ml/min，当气体充满罐体后关闭进气管和出气管〔3〕。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 将PC12细胞接种于六孔板中，NGF(100 ng/m l)刺激6 d 后分别进行 OGD 3、6、9、12、16、24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS洗涤3次，195μl结合液悬浮细胞，加入5μl FITC标记的Annexin V，室温避光染色30 min;PBS洗涤1次，用200μl 1倍缓冲液重悬细胞，加入5μl碘化丙啶(PI)，室温避光染色15 min，流式细胞仪检测及数据分析〔4〕。

1.2.4 Western印迹检测HSP70蛋白表达 将PC12细胞NGF(100 ng/m l)刺激 6 d 后进行 OGD 3、6、9、12、16、24 h，收集细胞并计数，加入预冷细胞裂解液重悬PC12细胞，冰上30 min使细胞完全裂解。收集裂解液，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。煮沸，离心，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(恒压100 V，3 h)，电泳完毕后转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。使用5%脱脂牛奶按比例适当稀释一抗，然后一抗孵育过夜。Fris盐酸缓冲液(TBST)洗涤聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)二抗，室温孵育2 h。TBST洗涤膜，增强化学发光法(ECL)显色液曝光〔4〕。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.0软件进行分析，最小显著性差异法和方差分析进行各组数据均值之间的两两比较。

2 结果

2.1 NGF诱导PC12细胞转化为神经元样细胞的培养 随培养时间增加，细胞突触增粗增长，数量无明显增加。培养1 d，细胞长出较短、较细的突触;培养2 d，突触数量及长度增加;培养3～6 d，突触长度可达胞体的4～5倍，交织成网状，呈典型的神经元形态。

2.2 共聚焦显微镜下观察MAP2蛋白的表达 100 ng/ml NGF诱导PC12细胞转化为神经元样细胞培养6 d，MAP2免疫荧光染色结果显示，可见呈散在分布、星形并带有较长突起的绿色荧光区域，与背景对比明显。

2.3 OGD诱导细胞凋亡检测 对照组LR象限的细胞比例为0.25%，OGD 3、6、9、12、16、24 h LR 象限的细胞比例分别为2.34% 、3.68% 、5.12% 、11.64% 、18.44% 、23.72% 。OGD 12 h后LR象限细胞明显增多，随着OGD时间的增加，细胞凋亡数明显增加，具有OGD时间依赖性。

2.4 OGD上调HSP70蛋白的表达 随着OGD时间的增加，HSP70表达逐渐增加，与对照组(0.10±0.01)相比，OGD处理后1、2、3、4、5、6 d HSP70 的表达量明显增加，分别为 0.16 ±0.03、0.32 ± 0.02、0.36 ± 0.03、0.55 ± 0.05、0.72 ± 0.11、0.78±0.18。可见，HSP70蛋白表达具有OGD时间依赖性，OGD可以有效诱导HSP70表达。见图1。

图1 不同时间OGD处理后HSP70蛋白的表达变化

3 讨论

PC12细胞是鼠肾上腺嗜铬细胞瘤单克隆细胞株，可以在NGF作用下长出长突起，转化成神经元样细胞。本研究利用PC12细胞为实验细胞株，NGF刺激后长出突触，具有典型的神经元形态。MAP2是特定的微管相关蛋白，与神经细胞突触长度和微管的形成密切相关，在神经元突触的生长中起重要作用〔5〕。本结果显示，PC12细胞经NGF诱导后，应用激光共聚焦显微镜观察突触的形成，结果表明NGF可以诱导PC12细胞产生MAP2，使PC12细胞产生突触，向神经元样细胞转化。

神经细胞的OGD多被用于在细胞水平模拟临床脑卒中过程。本研究以PC12细胞为实验细胞株，通过细胞持续性OGD建立OGD模型，模拟脑卒中的永久性局部脑细胞坏死过程，为进一步实验奠定基础。本研究在建立PC12细胞转化神经元的基础上，利用持续性OGD建立OGD模型，应用MTT法检测细胞活力，结果显示伴随OGD时间的延长，细胞存活率逐渐由99.7%下降至65.8%。同时应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果显示，OGD 12 h之前，虽细胞早期凋亡率逐渐升高，但变化并不明显;OGD 12 h之后，细胞凋亡率迅速升高至较高水平，OGD 24 h时达到高峰。12 h可能是神经元细胞从能量代谢障碍向衰竭、坏死过渡的域值。这种现象可能有两个原因:(1)这种变化规律反映了神经元本身可能具有一定的抗缺血缺氧能力;另一方面，短时间的OGD，神经元自身的病理生理改变过程可能存在某种内源性的抗损伤机制。HSPs可分为HSP90、HSP70、小分子HSP及泛素4个家族。其中HSP70具有保护脑细胞、增强脑细胞对缺氧的耐受性、进一步抵抗致死损伤的作用。短暂非致死性脑缺血/缺氧尚未出现明显的形态学变化前，HSP70已经迅速而有效地表达。因此，国内外实验研究常检测HSP用于衡量缺血缺氧损伤。本实验结果显示，随着OGD时间的延长，HSP70表达量明显增加，神经元样细胞在OGD时，通过HSP70蛋白有效表达，维护细胞的功能和生存。

1 Lee JY，Lee JW.Schmidt CE.Neuroactive conducting scaffolds:nerve growth factor conjugation on active ester-functionalized polypyrrole〔J〕.J R Soc Interface，2009;6(38):801-10.

2 Bhat KM，Maddodi N，Shashikant C，et al.Transcriptional regulation of human MAP2 gene in melanoma:role of neuronal bHLH factors and Notch1 signaling〔J〕.Nucleic Acids Res，2006;34(13):3819-32.

3 Larsena EC，Hatchera JF，Adibbatla RM.Effect of D609 of tricyclodecana-yl potassium xanthte(0609)on phospholipid metabolism and cell death during oxygen-glucose deprivation in PC12 cells〔J〕.Neuroscience，2007;46(3):946-61.

4 Genetos DC，Whitney K.Oxygen tension modulates neurite outgrowth in PC12 cells through a mechanism involving HIF and VEGF〔J〕.JMol Neurosci，2010;40:360-6.

5 Mnich K，Finn DP，Dowd E，et al.Inhibition by an andamide of 6-hydroxydopamine induced cell death in PC12 cells〔J〕.Int JCell Biol，2010;97:818497.

R74

A

1005-9202(2013)12-2806-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.033

吉林省自然基金资助项目(No.201015181);吉林省科技发展计划国际合作资助项目(No.20120723);吉林省科技发展计划青年基金资助在项目(No.20130522024JH，201201016)

1 吉林省人民医院

包晓群(1965-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事脑缺血研究。

徐忠信(1965-)，男，教授，博士生导师，主要从事缺血性脑损伤与保护研究。

何金婷(1980-)，女，博士，主治医师，主要从事脑缺血损伤研究。

〔2013-01-11收稿 2013-03-26修回〕

(编辑 袁左鸣)