小鼠耳蜗内外毛细胞胞吞功能的实验研究

李四军柳柯唐嗣泉杨仕明

1川北医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，四川省南充市文化路63号

2中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉研究所

小鼠耳蜗内外毛细胞胞吞功能的实验研究

李四军1柳柯2唐嗣泉1杨仕明2

1川北医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，四川省南充市文化路63号

2中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉研究所

目的研究小鼠内外毛细胞胞吞功能的异同，探讨毛细胞胞吞功能与动物听功能之间的关系。方法选择出生后1月龄的正常C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜在体外培养，以染料FM1-43为胞吞示踪剂，应用活细胞成像技术观察耳蜗内外毛细胞胞吞现象。结果 内毛细胞的胞吞活动主要集中在细胞底部及核下区，而外毛细胞的胞吞活动则主要集中在核上区和外侧壁区。而且，在不同的观察时间点上，内毛细胞对FM1-43的摄入量均显著高于外毛细胞(P<0.05)。结论内毛细胞的胞吞活动集中出现在细胞底部及核下区，说明这种胞吞活动与内毛细胞带状突触的功能密切相关；外毛细胞的胞吞活动主要出现在核上区及细胞外侧壁，表明这种活动更多参与了外毛细胞纤毛及离子通道。内毛细胞比外毛细胞具有更强大的胞吞功能，表明内毛细胞在听功能的发育和维持中发挥着更为关键的作用。

胞吞；内外毛细胞；FM1-43；突触

听觉的发育和维持与从耳蜗到听觉中枢整个传导通路的完整性密切相关。在听觉的传导和感知过程中，耳蜗外毛细胞主要负责声音的放大和机电转化作用[1],而内毛细胞则主要承担着突触囊泡向突触间隙的释放和激发突触后兴奋性反应的功能。这种神经兴奋活动向听觉中枢传导的同步性和一致性是声音编码的核心任务之一。在声音的编码过程中，耳蜗内毛细胞和听神经末梢之间形成的突触结构发挥着十分关键的作用，这个突触结构又被称为带状突触[2，3，4]。先前的研究表明，内毛细胞带状突触和内毛细胞的胞吞作用关系密切，似乎说明内毛细胞在胞吞作用中具有更加独特的表现以适应声音编码的需要[5，6]。然而，在声音的传导和编码过程中，内外毛细胞的胞吞功能是否具有显著的区别呢？如果两者间确实存在显著差别，那么这种差别又具有什么意义呢？到目前为止，学术界对于上述问题并没有十分明确的答案。为了解释上述疑问，本研究拟应用活细胞成像技术对小鼠耳蜗内外毛细胞的胞吞作用进行动态观察和比较，以探讨内外毛细胞在听力发育及成熟过程中的不同作用。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

选择健康的小鼠C57BL/6J（生后1月龄SPF级），雌雄不限，由中国军事医学科学院实验动物中心提供。本动物实验研究已通过中国人民解放军解放军总医院和川北医学院实验动物伦理委员会的批准。苯乙烯染料FM1-43（invitrogen），0.25%胰酶（hy⁃clone）,L-15培养基（gibco）,PBS(天津灏洋生物公司)，FBS（invitrogen），F12培养基（gibco）。

1.2仪器与设备

活细胞检测仪（Deltavision英国公司），解剖显微镜（olympus公司）。

1.3实验方法

1.3.1动物取材

实验用小鼠酒精消毒，充分麻醉后断颈，快速正中剪开颅骨，去除脑组织，取出两侧听泡置于盛有L-15培养基中；于在解剖显微镜下快速取出耳蜗，分离耳蜗听泡壳与耳蜗器官，分离基底膜与螺旋韧带连接处，操作过程中注意保护内外毛细胞，最终留下基底膜置于PBS中。

1.3.2实验步骤

①毛细胞分离：将分离好的基底膜放置于0.25%胰酶液中2min，将带有10%FBS培养基终止消化2min,以PBS液漂洗（3次，每次2min）,加入F12培养基分离的毛细胞中静置10min。②内外毛细胞的定位：将分离的毛细胞培养皿置于倒置活细胞仪下，用高倍（100 X）光学显微镜快速找到内外毛细胞并定位（根据毛细胞的纤毛和核位置以及内外毛细胞的形态）。③染色与活细胞显微镜观察仪：于拍摄前配好浓度为1.3mmol/L FM1-43混合液，拍摄开始后加入FM1-43混合液,活细胞显微镜100×油浸物镜下及动态拍摄，激发光波长FITC 488 nm,对所观察的内外毛细胞连续动态观察，扫描时间间隔10s。

1.4统计方法

计量资料以均值±标准差（±SD）来表示,不同时间点的内外毛细胞胞吞荧光值采用t检验。所有数据输入SSPSS17.0，P值<0.05为组间差异具有统计学意义。

2　结果

在本实验中，胞吞活动通过FM1-43的绿色荧光强度来表示。我们发现，FM1-43的荧光信号在内毛细胞的顶端快速出现(图1a)；进一步，随着时间的延长，FM1-43荧光信号强度在内毛细胞基底部和突触释放活跃结构区域也显著增强（图1b,c,d）；在120秒时间点，我们发现整个内毛细胞胞膜均显示出荧光信号，而在内毛细胞基底部及突触释放结构区域其强度明显增强。FM1-43荧光强度在120秒的最高峰值为445（见图1b）。在480秒时，荧光强度最高峰值为513，且突触释放活跃结构区域也显著增强伴随时间缓慢增加(见图1c)。在1200秒时，内毛细胞荧光最高峰值为588，突触释放活跃结构区域荧光强度达到高峰，然而此时内毛细胞荧光平均值增加不明显，突触释放活跃结构区域荧光强度未见增强(图1d，表2)，表明小鼠内毛细胞的胞吞活动在此时间点接近饱和。在本实验中，我们测得的内毛细胞荧光均值分别为：165.16±33.16（60s），177.63±34.02(120s)，258.17±32.33(480s)，385.25±64.06(1200s)。

另一方面，外毛细胞的胞吞实验则显示了完全不同的规律。FM1-43的荧光信号首先在外毛细胞胞体侧膜出现（见图2a）。随着时间的延长，FM1-43荧光信号强度在外毛细胞细胞核上区和基底上外侧区逐渐增强（见图2b），在加入FM1-43后480秒时，外毛细胞核上区域的荧光信号明显显现。此时外毛细胞荧光信号最高峰值为319（图2c）；1200秒时，FM1-43的荧光信号强度在外毛细胞核上区和基底上外侧区表现为最强，其最高峰值为405(图2d)，在此之后，外毛细胞的荧光信号强度不再有明显的增加，相反其强度似乎有所减弱(图2d，表2)。在外毛细胞中，我们测得的荧光均值分别为：132.83±15.4（60s），150.64±25.2(120s)，192.89±35.42(480s)，246.59±51.11(1200s)。通过比较内外毛细胞FM1-43荧光值，结果显示两者在不同时间点均具有统计学差异（±SD,P<0.05，见图3）。

图1通过活细胞成像技术显示的不同时间点小鼠内毛细胞的胞吞活动由弱到强的变化趋势。图中绿色荧光代表FM1-43信号，绿色椭圆形状为FM1-43标记下显示的内毛细胞，中间圆形淡染区域为细胞核。绿色荧光信号在核下区和细胞基底部较强。在本实验中，a为加入FM1-43后60s,b为120s,c为480s,d为1200s。标尺=5um。

图2活细胞成像技术显示的外毛细胞的胞吞活动变化趋势。图中绿色椭圆形形状为外毛细胞，中间圆形淡染区域为外毛细胞核。绿色荧光信号在核上区域和基底上外侧区域较强。本实验中a为加入FM1-43后60s,b为120s,c为480s,d为1200s。标尺=5um。

图3小鼠耳蜗内外毛细胞胞吞活动强度的比较。图中黑色曲线代表内毛细胞的胞吞功能（以FM1-43荧光值来表示），红色曲线代表外毛细胞的胞吞活动。统计分析显示两者之间存在显著性差异，内毛细胞的胞吞能力显著强于外毛细胞。

3　讨论

耳蜗毛细胞将声音信号转化为电信号并向听觉中枢传递过程中，需要快速和稳定的突触神经递质释放效率。由于每个内毛细胞大约只有280个突触囊泡，为了能够实现不断循环释放神经递质的功能，内毛细胞必须实现快速回收并充盈释放后的突触囊泡[7]。外毛细胞的作用则有所不同。它主要参与声音放大和机电转换作用。无论两种毛细胞的作用有多大区别，有一点是确定无疑的，就是所有这些作用的实现都离不开细胞的胞吞功能的参与。根据苯乙烯类染料FM1-43作为标记胞膜的特点[7],我们可以实时追踪突触囊泡的胞吞及循环过程，因此利用FM-143来观察细胞的胞吞功能目前已经是一种十分常见的实验方法。本实验结果显示，FM1-43的荧光信号在内毛细胞的顶端快速出现，并随着时间的延长，FM1-43荧光信号强度在内毛细胞基底部和突触释放活跃结构区域显著增强。有学者认为FM1-43通过胞吞作用在内细胞顶端快速出现是通过内毛细胞基底部快速Ca2+依赖介导递质释放所控制的，在内毛细胞顶端快速内吞作用后，驱动蛋白起着由顶端向基底部传递运输的作用[8]。在内毛细胞的带状突触区域FM1-43荧光信号增强，表明胞吞作用可能参与了神经递质囊泡的循环与释放过程。

有研究发现，Clarin-1蛋白参与毛细胞顶部和基底部以及带状突触的形成，敲除Clarin-1基因会影响带状突触的发育成熟及稳定，进而在突触区域的细胞胞吞活动也受到影响在本实验中，内毛细胞基底部高强度的荧光信号似乎表明了内吞作用参与了突触囊泡的形成及维持过程[9]。而在外毛细胞中，细胞基底部的囊泡数量比内毛细胞少[10]。这种囊泡的数量差别和分布和内外毛细胞功能是一致的。内毛细胞功能与声音信号编码和神经递质释放有关[8]。外毛细胞功能涉及声音的主动放大和调节作用[10]。我们的实验显示，外毛细胞的内吞作用主要发生在外毛细胞的顶部和侧壁。可能的解释是外毛细胞在顶部快速内吞是由Ca2+依赖所引发的，而在基底外侧部是由胞外Ca2+引内流引发的[11，12]。有报道表明，在细胞核区域胞吞转运与机械力信号处理有关，在基底外侧区域与机械信号传导有关[13]，有研究表明：荧光染料FM1-43进入外毛细胞是通过机械力转导通道进入细胞内的，意味着这些染料是通过毛细胞纤毛进入细胞浆的[13]。另外一个途径是通过TRPV1和P2X2离子通道[14]。耳毒性药物（如氨基糖甙类药物）进入外毛细胞的途径较多，其中之一是通过非选择性阳离子通道TRPA1，多途径进入的耳毒性药物在外毛细胞中累积从而损害外毛细胞而影响听力[15,16,17]。研究表明，FM1-43与氨基糖甙类药物可能共用了一些机械力通道进入了毛细胞[18]。也有研究表明：当FM1-43染料与氨基糖甙类药物共同存在则可能导致耳毒性作用在一定程度上的减弱。这类研究似乎表明了细胞内吞作用也可以作为耳毒性药物损伤毛细胞一个重要途径。还有研究表明:外毛细胞胞吞的信号先出现在外毛细胞的顶部，而溶酶体只限在外毛细胞顶部，而后转送到内质网和外侧壁，内质网是参与合成和运输蛋白作用的[19]，说明在外毛细胞的胞吞作用也可能参与了膜和膜成分循环与补充活动，特别是一些蛋白质，比如溶酶体转运膜成分的补充等，这与膜蛋白生命周期短暂以及需要持续不断的补充等特点十分吻合[13，20]。当然，上述结论在很大程度上仍然是推断性的，更加确凿的证据还需要今后更多的实验加以证实。至于外毛细胞的胞吞作用是否和分布在外毛细胞顶部及外侧壁的动力蛋白prestin密切相关，目前尚缺乏相关的文献报道，两者之间关联性也有待进一步的研究来证明。

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Different patternsof endocytosis identified inmurine cochlear inner and outer hair cells

LISijun1，LIUKe2，TANGSiquan1，Yang Shiming2
1.DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,Affiliated HospitalofNorth Sichuan MedicalCollege, 63Wenhua,Road,Nanchong,Sichuan,China
2.DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,PLAGeneralHospital,PLA InstituteofOtolaryngology; 28 Fuxing Road,Beijing,China
Corresponding author:TANGSiquan Email:tangsiqu@126.com

Objective To report different patterns of endocytosis inmurine cochlear inner and outer hair cells(ⅠHCs&OHCs).Methods Normal C57BL/6Jmice(1month old)were used to observe different patterns of endocytosis inⅠHCsand OHCs in vitro using live cell imaging of FM 1-43.ResultsⅠntense fluorescence density of FM 1-43 indicating massive endocytosis activities was identified at the base and blow the nucleus inⅠHCs.Ⅰn contrast,major endocytosis activities in OHCs were found at or near the lateral cellular wall and above thenucleus.FM 1-43 uptake inⅠHCswashigher than that in OHCs(P<0.05).Conclusion Activeendocytosis ator near the basolateral area of theⅠHC suggests that endocytosis inⅠHCsmay involve ribbon synapse plasticity.Endocytosisactivitiesnear the lateralwalland in the supranuclear area in OHC indicate thatendocytosis in OHC involves tip-linksor iron channels.Higher levelsof FM 1-43 uptake byⅠHCsmay indicateⅠHC’s key roles in hearing developmentandmaintenance.

Endocytosis;Ⅰnnerand outerhair cell;FM 1-43;Ribbon Synapse

R764.35

A

1672-2922（2015）03-545-04

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.03.038

国家重大基础研究项目（2012CB967900;2012CB967901)；国家自然科学基金项目（31040038）；北京市自然科学基金项目（5122040）；中国博士后科学基金项目（201003779，20100470103）和四川省教育厅基金（11ZA185）

李四军，在读硕士研究生，研究方向：内耳神经生物学

李四军和柳柯为本文并列第一作者

唐嗣泉:tangsiqu@126.com

2015-8-11 审核人：郭维维)