内耳注射药物建立新生鼠耳聋动物模型*

胡凌翔 吴皓 石复辛

最新病理学研究证明耳蜗毛细胞缺失或死亡为新生儿非遗传性聋的主要原因之一[1]，因此，重新生成或替代毛细胞功能为其理想的治疗策略[2]。毛细胞再生是近年来国内外研究的热点，转染毛细胞基因Atoh1[3]或抑制Notch信号通路[4]可成功将新生小鼠内耳支持细胞转化为毛细胞，但新生毛细胞是否有助于听力提高尚有待研究。研究新生毛细胞功能需要良好的可重复的耳聋动物模型，因此，本研究的主要目的为在新生鼠内建立以毛细胞缺失为病理特征的耳聋模型。

氨基糖苷类抗生素中的新霉素有较强的耳毒性，能诱导毛细胞死亡[5]。而毛细胞死亡与氨基糖苷类抗生素的剂量呈正相关，故可采用结合利尿剂腹腔注射的方式致成年鼠毛细胞死亡[6]。然而，利用耳毒性药物建立新生鼠耳聋动物模型的研究却未见报道，由于用于诱导新生鼠耳蜗毛细胞死亡的氨基糖苷类药物的剂量接近其致死量，故本研究拟使用微量注射系统在内耳直接给药的方式建立新生鼠耳聋模型，为今后进行毛细胞再生的研究提供技术手段。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 实验动物选用ICR怀孕母鼠，购买自上海SIPPR-BK试验动物有限公司。于孕18天购买，待新生鼠出生。出生后，将42只新生鼠按注射速度、液体种类及药物浓度不同分组(表1)，各组新生鼠于出生后第二天(P2)接受手术并内耳注射给药，于术后第1天(P3，Neo 50 1组)或术后第3天(P5，其余各组)处死，取耳蜗基底膜铺片染色，观察毛细胞改变。其中，对照组(Ctl)在术中仅用玻璃电极穿刺耳蜗底回侧壁，未注射液体。

表1 各组动物只数、注射总量、给药速度、药物浓度及处死时间

1.2内耳注射方法 新生鼠采用低温麻醉，包埋于冰中麻醉后，术区以碘伏和70%酒精消毒，置于冰袋上，取右侧卧位，在手术显微镜下，以显微剪于距左耳后沟1 mm处剪开皮肤，皮下组织稍向两侧分离后，以微型眼科动物撑开器撑开皮肤，即可见到胸锁乳突肌，稍向下分离下颌下腺后可见面神经，撑开胸锁乳突肌和下颌下腺，暴露白色耳环后缘，轻轻挑开并向前推移，暴露耳蜗侧壁及镫骨动脉，轻轻推开镫骨动脉下方膜性组织，将连接玻璃微电极(尖端直径15～20 μm)直接穿刺耳蜗底回外侧壁，利用纳升级显微注射系统(UMP3+MICRO4+NANOFIL,WPI Co.)将蒸馏水或新霉素素溶液(1、10、50、100 μmol/ml)按照各组动物的给药标准(表1)分别注入各组动物耳蜗，注射完毕停留约15秒后拔出玻璃微电极尖，将耳蜗侧壁的膜性组织复位，并将耳后切口复位，无须缝合。因注射给药时间不足3.5分钟，故总体手术时间约在7分钟左右完成。注射完成拔出玻璃电极后，因其直径较小，未见明显内淋巴液自耳蜗穿刺部位溢出。消毒后迅速将小鼠置于50 ℃保温箱复温，待苏醒后移至37 ℃母鼠笼中饲养至处死。

1.3耳蜗基底膜铺片及染色：手术后一天(P3)或三天(P5)新生鼠断头处死，迅速分离手术侧耳蜗，置入4%多聚甲醛溶液固定。浸泡30～60分钟后，

于PBS溶液中，在体视显微镜下分离耳蜗(由于新生鼠头部多为软骨，且耳蜗周围经手术解剖产生疤痕，需在体视显微镜下分离耳蜗，以免破坏耳蜗结构)，分离基底膜组织。经PBS溶液漂洗2遍后，行免疫荧光染色。基底膜置入一抗溶液中于4 ℃孵育过夜(0.1%Triton,1%BSA,5%驴血清，Proteus公司兔Myo7a多抗1:300，Santa Cruz公司羊Sox2多抗1:300)。PBS溶液漂洗3次后，置入荧光二抗(Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit 1:500，Alexa Fluor 594 Donkey anti-Goat1:500; Invitrogen公司)室温2小时染色。漂洗3遍后抗淬灭封片剂封片。

1.4显微镜观察及图像处理 使用徕卡DMI3000B荧光显微镜下观察基底膜改变并拍摄图像，Adobe Photoshop CS6进行后期图像处理。

1.5统计学方法 采用OFFICE EXCEL 2010进行数据统计及统计学差异分析。首先采用F检验行样本方差检验，然后采用T检验比较组间差异，以P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1内耳注射术后新生鼠的一般情况及耳蜗解剖所见 在P2时，小鼠对待低温麻醉耐受力好，在低温状态下，可耐受手术5～10分钟，手术后经及时复温，新生鼠可在3～5分钟内苏醒。手术伤口较小，长度不足0.5厘米，可不缝合，亦未见明显出血。伤口一般术后第一天粘连，至P5处死时已基本愈合。术后新生鼠发育如正常鼠，体重增加，42例均成活，个别可见因低温冻伤所致尾巴末端萎缩。

术后耳蜗大体改变：取材时见耳后切口干燥清洁，留有痂皮，伤口已粘连，无红肿化脓表现。耳蜗解剖分离时，可见手术伤口部粘连较重，和正常新生鼠比较，较难从颞骨中完整剥离耳蜗，须用显微剪仔细剔除耳蜗鼓岬外侧粘连分离。耳蜗底回外侧壁已完全愈合，未见进针点。P5时耳蜗有部分钙化，但无需脱钙即可完成分离基底膜结构。

2.2毛细胞机械性损伤与注射速度呈正相关 以不同速度注射蒸馏水后3天，可见，在20、60 nl/min速度下，耳蜗内、外毛细胞数量略有减少，但差异无明显统计学意义(图1)。从图2可见，在不同注射速度下，内毛细死亡较少，外毛细胞死亡也仅局限于耳蜗底回注射区域。

图1不同速度下耳蜗注射纯水后，毛细胞数量比较

图2单纯穿刺及不同速度注射蒸馏水3天后耳蜗基底膜铺片a：仅针刺耳蜗底回，未见毛细胞死亡；b：20 nl/min纯水注射200 nl，仅见注射部位若干外毛细胞死亡，无内毛细胞死亡；c：60 nl/min纯水注射200 nl，注射部位外毛细胞死亡多于内毛细胞

2.3毛细胞损伤与新霉素浓度呈正相关 以60 nl/min的速度，给予新生鼠耳蜗内分别注射1、10、50、100 μmol的新霉素200 nl后3天，与对照组相比，1 μmol/ml(Neo1组)新霉素可诱导23%的外毛细胞死亡但内毛细胞无显著变化；10 μmol/ml(Neo10组)诱导27%的外毛细胞和8.5%内毛细胞死亡；50 μmol/ml(Neo50组)、100 μmol/ml(Neo100组)可分别诱导外毛细胞死亡数量约68%和74%，内毛细胞约达80%和85%，并存在明显差异(P<0.05)。Neo1、10、50、100组外毛细胞数量变化存在明显差异(P<0.05)。与同样速度注射纯水组(H2O 60组)相比，Neo50、100组内、外毛细胞数量均明显减少(图3)。

图3 不同浓度新霉素注射后3天，各组毛细胞数量比较(*与对照组比较，P<0.05；#与H2O 60组比较，P<0.05)

不同浓度新霉素内耳注射后，内、外毛细胞死亡均由底回向顶回蔓延，50和100 μmol/ml可诱导底回和中回内、外毛细胞全部死亡。其中高浓度下(Neo50、100组)内毛细死亡较外毛细胞明显，而低浓度下(Neo1、10组)则相反(图4)。

2.4新霉素快速诱导毛细胞死亡 以60 nl/min的速度，给予新生鼠耳蜗内注射50 μmol/ml的新霉素200 nl后1天(Neo50 1组)基底膜观察，内、外毛细胞已大量死亡，与新霉素给药后3天(Neo50组)相比内毛细胞(P=0.38)、外毛细胞(P=0.5)数量差异无统计学意义(图5、6)。

图4 1、10、50、100 μmol新霉素注射3天后耳蜗基底膜铺片a： 1 μmol/ml、b：10 μmol/ml底回注射，可见底回内、外毛细胞均有损伤；c：50 μmol/ml、d 100 μmol/ml底回注射，可见仅剩顶回内、外毛细胞存活

图5 Neo50组(术后3天)与Neo501组(术后1天)毛细胞数量比较

2.5新霉素对支持细胞无影响 50 μM新霉素，以60 nl/min、总量200 nl注入新生鼠耳蜗后3天(Neo50组)，可见内、外毛细胞有明显死亡，底回、中回完全死亡，仅剩顶回部分毛细胞依旧存活；而耳蜗支持细胞(Sox2+)分布均匀，无明显死亡(图7)。

3 讨论

研究显示，小鼠耳蜗毛细胞对氨基糖苷类抗生素的抵抗力似乎比人类要高[7]。在小鼠中，使用氨基糖苷类抗生素与利尿剂结合，建立的药物性聋模型为耳聋的发病机制及治疗的研究打下了基础。利

图6新霉素50 μmol/ml内耳注射后1天耳蜗基底膜铺片底、中回大部分内、外毛细胞死亡，中回近顶回位置毛细胞死亡中

图7 Neo50组新生鼠耳蜗基底膜铺片a：注射新霉素50 μmol/ml后3天，仅残余顶回毛细胞；b：支持细胞形态完好；c：合并图像

尿剂的使用一方面使血液浓缩，使耳蜗供血减少造成短期的缺血缺氧损伤；同时，由于血管纹系统的这种损伤，使血-迷路屏障开放，从而使氨基糖苷类抗生素能更多地进入外淋巴液，进而进入内淋巴被毛细胞摄取，造成内耳损伤[8]。然而，这一致聋方法似乎并不适用于新生鼠。在成年鼠，大剂量利尿剂与氨基糖苷类抗生素联合应用对肾脏的严重毒性可能是致死性的，有报道称这一方法的致死率高达50%[7]，推测新生鼠的致死率更高。为了进一步开展新生儿毛细胞再生的研究，建立有效新生鼠耳聋动物模型非常必要[2]，因此本研究尝试通过内耳给药致聋的方法来建立新生鼠耳聋动物模型。

研究显示，与单纯针刺耳蜗底回比较，在分别以20、60 nl/min注射200 nl纯水后，由基底膜铺片可见，在注射部位，仅有个别外毛细胞损伤，但内、外毛细胞的总数无显著性差异。Stover等[9]报道比较通过圆窗或底回开窗的方式使病毒转染豚鼠耳蜗，两者术后5天ABR反应阈均无明显升高。然而，在Iizuka等[10]的研究中，新生鼠通过耳蜗底回开窗的方式转染病毒，术后ABR反应阈升高20 dB。耳蜗开窗后对听力的影响可能与开窗的大小及脑脊液瘘、注射液体的种类、注射速度及注射总量有关。从文中结果看，采用耳蜗底回微创打孔内耳给药法后，内毛细胞无明显变化，而外毛细胞仅注射部位有个别死亡，且观察到，单纯针刺方法不会出现内、外淋巴液渗漏，在限定的速度和总量下对内耳结构无显著影响。推测本研究所采用的给药方法本身对听力的影响很小。

在内耳毛细胞再生领域的研究中，既杀伤毛细胞，又保证支持细胞完好，从而提供毛细胞再生的来源是及其重要的前提。本研究结果显示，即使内耳注射高浓度新霉素后，毛细胞残留顶回部分，而整个耳蜗基底膜的支持细胞分布均匀，形态较好。这可能与氨基糖苷类抗生素进入毛细胞并杀伤毛细胞的机制有关。支持细胞可能缺乏类似毛细胞的MET(mechano-electrical transduction)离子通道[11,12]，或者其不表达Myosin7a[13～15]，从而阻止了氨基糖苷类抗生素对其的毒性作用。

本研究通过对新生鼠内耳直接给药的方法，建立了有效的新生鼠耳聋模型。这种采用耳蜗底回微创打孔技术，通过微泵对耳蜗底回中阶进行微量注射的内耳给药方法，对内耳结构无显著损伤。本实验所采用的新霉素内耳给药方法，可诱导特异性的、快速而较完全的毛细胞死亡，对内耳支持细胞却无影响，为今后进行毛细胞再生研究打下基础，同样这种内耳微量注射方法可应用于内耳给药及基因治疗的研究及临床工作。

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