新霉素对脑胶质瘤细胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表达的影响

赵 佳，郝利铭，姜文华，孔德霞，李洪成，周 莉

（吉林大学基础医学院组织学与胚胎学系，吉林长春130021）

新霉素对脑胶质瘤细胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表达的影响

赵 佳＊，郝利铭，姜文华，孔德霞，李洪成，周 莉

（吉林大学基础医学院组织学与胚胎学系，吉林长春130021）

目的探讨新霉素对脑胶质瘤细胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表达的影响。方法采用人脑胶质瘤细胞U251，DMEM培养基添加10%胎牛血清培养。MTT细胞活性实验检测细胞增殖，Real Time PCR检测mRNA表达情况，酶联免疫吸附实验检测蛋白表达。结果MTT结果表明，新霉素对U251细胞增殖存在抑制作用，并以剂量依赖的方式进行，并发现新霉素的抑制作用随时间增强。Real Time PCR结果显示，新霉素作用后U251细胞中PDGF、VEGF和血管生成素mRNA的表达都受到不同程度的抑制，分别降低了26.75%、38.23%和43.87%。ELISA分析表明新霉素能够降低PDGF、VEGF和血管生成素蛋白水平的表达。结论新霉素能够抑制脑胶质瘤细胞U251中PDGF、VEGF和血管生成素的表达并抑制脑胶质瘤细胞增殖。

新霉素；脑胶质瘤；PDGF；VEGF；血管生成素

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1579）

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性脑肿瘤，其富含血管，是高度血管依赖性的恶性肿瘤，血管新生化程度与其恶性程度、生物侵袭性、临床复发和预后均密切相关［1］。最近研究发现，新霉素在血管发生过程中具有抑制作用。新霉素可抑制血管生成素在内皮细胞中发生核转移，进而抑制血管发生和细胞增殖，并且新霉素对前列腺癌的生长和血管发生具有抑制作用［2－3］。肿瘤血管发生受多种血管生成因子的调节，本文中，我们研究了新霉素对脑胶质瘤细胞增殖的作用，并进一步分析新霉素对三种重要的血管发生因子：PDGF、VEGF和血管生成素表达的影响，探讨新霉素抑制脑胶质瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人脑胶质瘤细胞U251购自上海细胞研究所细胞库。DMEM培养基购自GIBCO，胎牛血清购自TBD公司，MTT购自Sigma公司，ELISA检测试剂盒购自R＆D公司。

1.2 细胞培养

人脑胶质瘤细胞U251采用DMEM培养基，添加10%胎牛血清培养。置于37℃、5%CO2孵箱中，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 MTT细胞活性检测实验

收集对数期细胞，以6×103cells／孔的密度接种于96孔板，培养24h后，加入不同浓度新霉素溶液以及对照生理盐水，继续培养0、12、24、48、72h。吸去上清，向每孔加入100μl MTT工作溶液（0.5 mg／ml），继续培养4h。小心吸去上清，加入100μlDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪492nm处测量各孔的吸光值。细胞增殖抑制率＝（对照组A值－干扰组A值）／对照组A值×100%。

1.4 细胞总RNA的提取

采用Trizol法提取细胞总RNA（Invitrogen Corporation，Grand Island，New York，USA）。每组细胞沉淀中加入1ml Tizol，吹打均匀，静止5 min。加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀1min，静置3 min；4℃下12 000r／min离心10min；将上清液小心转移到DEPC处理的1.5ml EP管里，加入500 μl异丙醇，混匀，室温放置10min；4℃下15 000r／min离心10min；弃上清，75%乙醇（约1ml）洗2次，4℃，12 000rpm，离心5min；弃上清，室温干燥（5－10min）；用30μl Rnase－free水溶解RNA，于分光光度计上测定RNA浓度及纯度，分装，－80℃保存备用［4］。

1.5 反转录

取1μg总RNA，按照Reverse Transcription System（Promega，Madison，USA）说明书进行操作。将反转录得到的cDNA片段用DEPC水稀释5倍，分装，－80℃保存备用。

1.6 Real Time PCR

反应体系为：12.5μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix，Sense引物（2μM）2.5μl，Antisense引物（10μM）2.5μl，模板2μl，dH2O（灭菌蒸馏水）5.5μl。

反应条件为：95℃预变性10min，95℃30s，52℃60s，72℃30s，扩增40个循环。反应在荧光定量PCR仪（Stratagene，Mx3000P，USA）上进行。

每份标本设3个复孔检测，取其循环阈值均值（Ct值，即PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数）。以管家基因β－actin为内参，采用比较2－△△Ct法分析各基因在细胞中的相对含量。

PCR反应中用到的引物：

β－actin引物：

Sense：5’－TCGTGCGTGACATTAAGGAG－3’

Antisense：5’－ATGCCAGGGTACATGGTGGT－3’PDGF引物：

Sense：5′－CTGCTCATCATATTCCAACCC－3′

Antisense：5′－CCTACCACAgTCTCCCTCCT－3′

VEGF引物：Sense：5’－GCCGTCCAATCGAGACCCT－3’Antisense：5’－CATGGCGATGTTGAACTCCTC－3’

Angiogenin引物：

Sense：5’－CATCATGAGGAGACGGGG－3’

Antisense：5’－TCCAAGTGGACAGGTAAGCC－3’。

1.7 酶联免疫吸附实验（ELISA）

收集细胞上清液，采用双抗体夹心法分别检测PDGF、VEGF和血管生成素的表达情况。严格按照ELISA Kits说明书进行操作。使用全自动酶标仪（Multiskan MK3，Finland）进行吸光值检测。

2 结果

2.1 新霉素抑制脑胶质瘤细胞增殖

采用MTT法检测新霉素对脑胶质瘤细胞增殖的影响，结果如图1所示。MTT结果表明，作用48 h后，随着新霉素浓度的增加，U251细胞的增殖率逐渐下降（图1A），新霉素浓度为100μM时，U251细胞的增殖减少了12.27%。而400μM时，细胞的增殖减少了58.38%。说明新霉素对U251细胞增殖存在抑制作用，并以剂量依赖的方式进行。同时我们检测了不同时间新霉素对U251细胞增殖的作用情况，发现新霉素的抑制作用随时间增强，如图1B。

2.2 新霉素抑制脑胶质瘤细胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表达

首先我们从mRNA水平上检测新霉素对PDGF、VEGF和血管生成素表达的影响。收集U251细胞，提取细胞总RNA，进行反转录，以反转录后的cDNA为模板进行Real Time PCR。结果如图2，与对照组细胞相比，新霉素作用后U251细胞中PDGF、VEGF和血管生成素mRNA的表达都受到不同程度的抑制，分别降低了26.75%、38.23%和43.87%。

为进一步验证新霉素对3种蛋白表达的影响，我们进行了ELISA分析。收集细胞上清液，采用双抗体夹心法分别检测3种蛋白的表达情况，结果如表1、图2。从图中可以看出，新霉素作用后，降低了PDGF、VEGF和血管生成素蛋白水平的表达，抑制率分别为29.77%、46.38%和42.48%。

表1 各组胶质瘤细胞中PDGF、VEGF和血管生成素蛋白的表达（pg／ml）

图1 MTT检测新霉素对U251细胞增殖的影响

图2 Real Time PCR检测新霉素对PDGF、VEGF和血管生成素mRNA表达的影响

3 讨论

脑肿瘤是中年男性与癌症有关的死亡中第三位最常见的死因，其起源一般为星形细胞、室管膜细胞、少枝胶质细胞和混合来源。胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，占所有病例的60%［5］。目前尽管采用手术、放疗和化疗等多种手段，但对脑胶质瘤的治疗仍很有限。近年来研究发现，血管生成因子与肿瘤的发生发展密切相关，血管为肿瘤提供营养物质并排出代谢产物，肿瘤通过新生血管发生转移；血管生成因子也能够直接促进肿瘤细胞的增殖［6－7］。

我们的实验证实新霉素抑制脑胶质瘤细胞增殖，并且新霉素能够抑制脑胶质瘤细胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表达。PDGF、VEGF和血管生成素是3种重要的血管发生因子，在脑胶质瘤中均高表达，并在脑胶质瘤的发生发展过程中发挥重要作用［8－10］。提示新霉素可能是通过抑制这3种因子的表达，从而抑制了肿瘤细胞的生长。

新霉素是氨基糖苷类抗生素的一种，它能够与原核生物核糖体的小亚单位结合，从而导致mRNA错读，继而抑制翻译过程，所以它对许多有机体都具有杀菌作用［2］。而新霉素与其结构类似的化合物如基因菌素（G418）最大的区别在于，新霉素对于大多数的真核细胞没有毒性，因为其不与真核生物的核糖体结合［3］。

有报道表明新霉素能够抑制血管生成素、aFGF、bFGF等在内皮细胞中发生核转移，进而抑制它们诱发的血管发生，并且新霉素对基础水平和自发的内皮细胞增殖没有显著的抑制作用，但能够显著抑制由血管生成素、aFGF、bFGF等诱发的内皮细胞增殖［3］，这说明新霉素比非特异性的细胞生长抑制剂具有更好的针对性和高效性。本实验结果表明，随着新霉素浓度的增加，U251细胞的增殖率逐渐下降，新霉素对脑胶质瘤的抑制作用存在剂量依赖。100μM新霉素使细胞增殖减少了12.27%。而400μM时，细胞增殖减少了58.38%。

目前新霉素的毒性情况是已知的，当新霉素过量使用时，会引发肾和第八神经损伤［11］。在临床上使用新霉素治疗细菌感染，口服剂量为4－8g／天，肌内注射剂量为1－2g／天。本实验中新霉素抑制U251细胞增殖的IC50值为375μM，这一浓度低于已报道的其在细胞培养物中引起毒性所需的浓度（～1mM）［12］。

综上，新霉素能够抑制脑胶质瘤细胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表达并制脑胶质瘤细胞增殖，而三种因子为重要的血管发生因子，所以理论上新霉素不但可以抑制脑胶质瘤生长所必需的新血管发生，又对脑胶质瘤细胞的增殖具有直接的抑制作用，那么新霉素作为抗肿瘤药物将会比单纯抑制肿瘤血管发生或细胞增殖的抑制剂更有效。

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Effect of neomycin on cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in glioma cells

ZHAO Jia，HAO Li－

ming，JIANG Wen－hua，et al.（Department of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021，China）

ObjectiveTo observe the effect of neomycin on cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in U251glioma cells.MethodsThe cell proliferation was analyzed using MTT.Real Time PCR and ELISA were applied to investigate the expression of PDGF，VEGF，angiogenin.ResultsThe MTT results showed that neomycin positively inhibited the cell proliferation of U251cells and the inhibition was enhanced by dose－dependent and time－dependent.Real Time PCR and ELISA results showed that neomycin inhibited the expression of PDGF，VEGF，angiogenin both on mRNA level and protein level.ConclusionNeomycin positively inhibited the cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in U251glioma cells.

neomycin；glioma；PDGF；VEGF；angiogenin

R730.264

A

赵佳，31岁，女，博士，讲师，主要从事肿瘤细胞生物学研究。

2013－06－06）

1007－4287（2014）10－1579－04

＊通讯作者