螺旋神经节外周投射发育的体外观察

孔德秋 黄乃邦 廖辉 敖华飞 阮清伟

哺乳动物耳蜗发育早期［小鼠为胚胎期18 天（embrgonic day18，E18）～出生后6 天（postnatal day6，P6）］，螺旋神经节（spiral ganglion neurons，SGN）外周纤维通过生长、纯化、退缩及突触剪切等一系列过程来消除不合适分支，形成与毛细胞之间特定的突触连接，构成耳蜗音频定位的结构基础［1］。研究发现，螺旋神经节这种外周靶支配可能受多种神经营养因子（BDNF、NT－3）和细胞外基质的影响［2，3］，并且在体研究存在实验干预、解剖操作困难等诸多不便，因此，需要建立一种体外螺旋神经节支配模型作为在体研究的有益补充，而体外培养时，螺旋神经节树突是否还能像在体时一样生长发育，特别是体外I型和II型螺旋神经节传入周围投射的发育目前还没有相关报道。本实验拟通过体外培养胚胎小鼠Corti器，观察两型螺旋神经节外周投射的发育过程，比较其与在体发育的异同，从而建立螺旋神经节体外支配模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康成年C57BL／6小鼠12对作为种鼠，体重25～35g，由上海复旦大学实验动物科学部提供。晚8点合笼，次晨8点可见阴栓即确定为受孕第1天，小鼠的平均孕期为18～21天。选胚胎第16天（E16）小鼠18只，共取36只Corti器，分为三组，每组12只，分别体外培养2、3、4天，另选4只出生当天（P0）小鼠的8只Corti器，一起行免疫组织化学染色。

1.1.2 主要试剂和仪器 ①胶原凝胶液（即鼠尾胶，Collagen I，Rat Tail，GIBCO 公司）即以0.02N醋酸加50×胶原溶液（N Acetic Acid 7.8μl ＋Collagen 130μl＋H2O 6.3ml）为A 液，10×Eagle培养基溶液为B 液，2%碳酸钠溶液为C 液，按A ：B：C＝9：1：1比例配成；②无血清培养液（Serum—Free Medium），即小牛血清蛋白（BSA）2g，Serum－Free Supplement 2ml，2%葡萄糖4.8ml，青霉素G 0.4ml，200mM 谷氨酰胺2ml，1×BME 190.8 ml；③Neuronal Classβ－Tubulin（TUJ1）Rabbit Monoclonal Antibody lgG2a（1：2 000），Covance公司；④Rabbit anti－peripherin polyclonal antibody（1：00），Chemicon 公司；⑤conjugated goat antirabbit IgG （1：100），FITC anti－mouse lgG2a（1：100），rhodamine－phalloidin（1：150）均购自Bio－Legend 公司；⑥共聚焦显微镜（Leica TCS SP2 AOBS，Germany）。

1.2 实验方法

1.2.1 耳蜗基底膜组织培养 取胶原凝胶液（按A：B：C＝9：1：1的比例）滴人直径35毫米的培养皿中，待1刻钟左右溶液出现凝胶化之后，加入无血清培养液，加入的液体量以刚好浸过胶原滴为止。按照确定的日期，对怀孕16天的小鼠全麻（苯妥英纳，90mg／kg）下剖腹取出胚胎，置入预冷的无菌Hanker液中，移入超净工作台，剪开其颅腔，去除脑组织，暴露颅底，分离双侧颞骨，在放大20～40倍解剖显微镜下，依次剥离外耳道周围、耳蜗表面组织；用尖镊挑开耳蜗外的软骨壁，暴露基底膜，尽可能完整的将含有螺旋神经节细胞和毛细胞的基底膜从蜗轴上分离出来，将其移人无血清培养液中，再逐步将其移到胶原凝胶滴的中央表面铺放平整，尽量使基底膜片段的凹面向下铺在胶原滴上。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24小时后加入2ml培养液，此后培养液2 天换一次。每日在倒置显微镜下观察Corti器组织的形态变化及附壁情况，选择形态和附壁良好的Corti器作为实验组，培养2、3、4 天后分别终止培养，各组可用Corti器分别为8、7和8只。

1.2.2 耳蜗基底膜免疫荧光染色 将出生当天的4只小鼠颈椎脱臼处死后浸于4 ℃75%酒精中消毒5min，无菌条件下取出颞骨，置入预冷的无菌Hanker液中。在放大20～40倍解剖显微镜下，打开听泡，剔除耳蜗骨壳及周围结缔组织，暴露基底膜，将含有螺旋神经节细胞和毛细胞的8只基底膜从蜗轴上分离出来，浸泡在4 ℃、4% 甲醛溶液中固定2小时以上；再从37 ℃温箱中取出体外培养的表面覆盖有胶原凝胶的基底膜，在4 ℃、4% 甲醛溶液中固定2小时以上，用细镊沿培养皿的底部刮脱培养皿中带有基底膜的胶滴，所有标本用PBS洗涤3×5min；0.1%Triton X 一100处理15min，5%goat serum 封闭2～3小时；根据不同的显色要求加入一抗：β－Tubulin（TUJ1）抗体（1：2 000）、anti－peripherin抗体（1：1 000），混和5%goat serum＋0.25%Triton X－100 ＋0.1M PBS，室温孵育过夜，PBS洗涤3×15 min；加入二抗：FITC conjugated goat anti－rabbit IgG （1：100），FITC antimouse lgG2a（1：100），室温避光放置2小时。毛细胞染色rhodamine－phalloidin（1：150），室温15 min。PBS洗涤3×15min，轻轻摇动，盖玻片封片。

1.2.3 影像采集和分析 免疫荧光染色后的基底膜切片置于LSCM 倒置显微镜下进行观察，选共聚焦专用平场复消色差20×、40×镜头，荧光标记用波长494nm／518nm，外毛细胞顶部至螺旋神经节区域自上而下以0.5μm 的层距进行连续扫描，获取清晰二维图像，图像存为1 024×1 024像素类型。

2 结果

2.1 螺旋神经节细胞树突向外生长并支配毛细胞 胚胎16天（E16）小鼠Corti器体外培养2天，可见螺旋神经节散在分布，SGN 分布区内纤维交织成丛，称为螺旋节内束，TUJ1 标记的神经纤维数量多，且之间相互交叉，向外呈放射状生长，越过内毛细胞，到达外毛细胞区域并发出分支（图1a、b）；peripherin染色的II型神经突同样越过内毛细胞区，到达相当于外毛细胞分布区（图1c），但是图1c中到达外毛细胞区的纤维数量和图1a、b相比明显减少，可知图1a、b中到达外毛细胞区的神经突中包含部分的I型神经纤维。

2.2 放射束和内螺旋丛形成 E16天小鼠Corti器体外培养3天（图2、3），从SGN 发出的外周纤维聚集成多条间隔明显的放射状神经束，内含多条神经纤维，束与束之间的交叉减少（与图1比较），内毛细胞基底外侧部接受来自不同神经束的纤维支配，交叉形成内螺旋丛，越过螺旋隧道的纤维到达外毛细胞，生长迅速，沿线性分布的外毛细胞延伸，不同行的纤维之间互相交叉，同时可见纤维向耳蜗底回弯曲。

2.3 内、外螺旋束形成 E16天小鼠Corti器体外培养4天（图4）和体外培养3天Corti器相比，SGN排列更加紧密，毛细胞下游的外周纤维数量减少，神经束间隔加大，束间的纤维交叉更加稀少。神经束底端连接SGN，顶端连接内毛细胞，并且一个内毛细胞主要由一条神经束发出的纤维支配，在内毛细胞区形成内螺旋束。到达外毛细胞的纤维明显减少，不同行之间的纤维交叉减少，与在体发育Corti器的三条清晰外螺旋束相比，此时为不完全外螺旋束。

2.4 螺旋神经节外周投射体外与在体发育比较 出生当天小鼠（P0）Corti器一排内毛细和三排外毛细胞排列紧密（图5a），内、外螺旋束清晰（图5c），毛细胞和神经突呈对应关系（图5e）；体外培养3天的Corti器中，毛细胞排列紧密，但有少量增生（图5b），外螺旋束存在少量分支（图5d），形态不规则，毛细胞和螺旋束之间保持对应关系。与P0 相比，体外培养的螺旋神经节树突总体上保持了相同的靶支配模式。

3 讨论

在活体内，小鼠妊娠期通常为18～21 天，E10时，SGN 刚可以被辨认出；E13～E15，SGN 外周纤维到达听觉上皮内；E16，毛细胞开始分化，大部分纤维停留在内毛细胞区，少量纤维穿过螺旋隧道到达外毛细胞，在整个妊娠期，SGN 树突都呈放射状生长，无弯曲转向；P0时，外周纤维生长迅速，横穿整个外毛细胞区，并向底回弯曲生长；P2时，三条清晰的外螺旋束形成，之后内螺旋束才逐渐出现。本实验采用鼠尾胶体外培养Corti器［4，5］，利用β－Tubulin抗体特异性显示I型和II型SGN 及其树突、peripherin抗体标记II型SGN 及其树突、phalloidin示踪毛细胞，直观的展现了螺旋神经节树突体外发育的过程，结果显示：体外培养2天，两型SGNs树突向外周生长延伸，同时支配内毛细胞和外毛细胞，与以往在体E18时观察到的SGNs发育一致［6］，体外培养3天，相当于在体P0期，SGN 外周纤维聚集成束，在内毛细胞基底外侧面交织形成内螺旋丛，越过Corti器的纤维沿外毛细胞向底回弯曲生长；体外培养4天，与在体P1～P2时间相对应［7］，SGN 外周纤维进一步退缩、纯化，消灭部分螺旋神经节与外毛细胞间突触，形成内螺旋束和带分支的外螺旋束。可见，体外培养的Corti器神经投射，除了内螺旋束的形成提前外，基本上保持了与在体相同的外周投射发育。分析原因可能为，内、外螺旋束的形成是两个相对独立的过程，它们与毛细胞的分化成熟密切相关，毛细胞分化成熟的早晚决定了内、外螺旋束的形成时间。最终，内毛细胞由I型耳蜗神经节支配，而外毛细胞由II型感觉神经元支配。每个I型神经节细胞仅与一个单独的内毛细胞相接触，约15～20个I型耳蜗神经节细胞为一个内毛细胞向中枢提供平行的通道，但每个II型神经节细胞外螺旋纤维在行进中支配约30～60个外毛细胞，由数目很少的II型耳蜗神经节细胞向中枢提供很多外毛细胞整合的信息［8］。

Sobkowicz等［9］曾利用双盖玻片装置（maximow slide assembly）加动物血清体外培养小鼠Corti器，全基底膜银染，胞内注射辣根过氧化物酶（HRP）标记细胞，电子显微镜下观察SGN 外周投射模式的发展变化，其过程较复杂。本实验将Corti器平铺在多孔培养皿中的鼠尾胶内培养，操作相对简单，培养基用的是去血清营养液，化学成分固定，排除了影响神经生长的外在因素，并可根据需要改变培养条件。免疫组织化学染色相对银染和HRP染色来说，特异性强，可以区分I型和II型螺旋神经节纤维发育的不同阶段。但本实验同时存在以下不足：TMRD （tetramethylrhodamine－conjugated dextran）可以特异性的示踪I型SGNs及其树突，有效的将两型神经突区别开来，但是其染色必须涂在神经纤维新鲜的断面上，本实验对刚取下的胚胎鼠耳蜗应用TMRD 染色，培养后镜下显示只有I型SGNs胞体着色，分析原因可能为：①TMRD 对新生神经纤维产生毒性，使神经纤维退缩消失；②浸泡在培养液中的Corti器，TMRD 被稀释，不足以染色神经远端；③随着纤维的增长，I 型SGNs 吸收的TMRD 相对不足，从而无法染色。所以本实验不能对I型SGNs树突单独染色，如何利用TMRD 或其它染色剂示踪体外培养的I型SGNs树突还有待进一步研究。

图1 E16小鼠Corti器体外培养2天螺旋神经节细胞树突向外生长并支配毛细胞 a、b、TUJ1染色（绿色），显示两型螺旋神经节细胞和纤维（×20）；c，peripherin染色（绿色），显示II型螺旋神经节细胞和纤维（×40）。RF（radial fibers）：放射纤维；OHCR（out hair cell region）：外毛细胞区；SGNs（spiral ganglion neurons）：螺旋神经节细胞图2 E16小鼠Corti器体外培养3天全基底膜铺片 TUJ1染色（绿色）（×20），显示两型螺旋神经节细胞和纤维。HC（hair cell），毛细胞；RF（radial fibers）：放射纤维；SGN（spiral ganglion neurons）：螺旋神经节细胞；CAI（central afferent innervations）：中央传入投射图3 E16小鼠Corti器体外培养3天放射束和内螺旋丛形成 a，b，TUJ1染色（绿色）（图a×40，图b×20），显示两型螺旋神经节细胞和纤维。ISP（inner spiral plexus）：内螺旋丛；OSB（outer spiral bundles）：外螺旋束；SGNs（spiral ganglion neurons）：螺旋神经节细胞图4 E16小鼠Corti器体外培养4天内、外螺旋束形成 a，b，c，d，TUJ1染色（绿色）（a，b×20，c，d×40），显示两型螺旋神经节细胞和纤维。ISP（inner spiral plexus）：内螺旋丛；OSB（outer spiral bundles）：外螺旋束；SGNs（spiral ganglion neurons）：螺旋神经节细胞图5 E16小鼠Corti器体外培养3天（图b、d、f）和出生当天（P0）（图a、c、e）毛细胞和SGNs树突的发育 a，b，phalloidin染色（红色），图中显示毛细胞；c，d，peripherin染色（绿色），显示II型神经节细胞和纤维；e，f分别为图a，c和图b，d叠加后的图像，×20

总之，本实验体外培养的带Rosenthal隧道的基底膜，SGNs保持了与在体发育相同的外周靶支配模式。在此模型中，传出纤维和SGN 轴突缺失，大部分SGN 外周纤维还没到达毛细胞，因而可以作为一个专门研究螺旋神经节树突发育的替代模型。

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2 Wang Q，Green SH.Functional role of NT－3in synapseregeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro［J］.J Neurosci，2011，31：7 938.

3 Evans AR，Euteneuer S，Chavez E，et al.Laminin and fi－bronectin modulate inner ear spiral Ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay［J］.Dev Neurobiol，2007，67）：1 721.

4 宣伟军，丁大连.小鼠耳蜗毛细胞体外培养研究方法［J］.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2005，3：121.

5 刘英鹏，鄢开胜，王建亭，等.新生大鼠耳蜗Corti器体外培养及其转基因表达［J］.听力学及言语疾病杂志，2006，14：127.

6 Fekete D，Campero AM.Axon guidance in the inner ear［J］.Int：J Dev Biol，2007，51：549.

7 Driver EC，Kelley MW.Transfection of mouse cochlear explants by electroporation［J］.Curr Protoc Neurosci，2010，4：4.

8 Rubel EW，Fritzsch B.Auditory system development：primary auditory neurons and their targets［J］.Annu Rev Neurosci，2002，5：51.

9 Sobkowicz HM，Loftus JM，Slapnick SM.Tissue culture of the organ of corti：part I［J］.Acta Oto－laryngologica，1993，113：1.