Stathmin siRNA 抑制人胃癌SGC－7901 细胞裸鼠移植瘤的生长并诱导细胞凋亡*

张彩凤， 夏永华， 李贞娟， 周慧聪， 韩 宇， 孙 矗

(新乡医学院1第一附属医院消化内科，2第一附属医院皮肤科，32007 级临床医学系，河南 新乡453100)

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，虽其发生率较过去50 年明显下降，但它仍然是世界上排名第二的致死性肿瘤［1］，其5 年生存率仍然相当低下［2］。目前随着诊疗水平的不断改善，早期胃癌患者的生存率大幅度提高，但是晚期胃癌患者的预后仍然较差［3］，因此寻找新的分子靶点诊断和治疗胃癌显得十分重要。

微管解聚蛋白stathmin 是一类十分重要的微管调控蛋白，在有丝分裂纺锤体的聚合和解聚中发挥关键作用［4－5］。近来研究发现，stathmin 在多种不同的人类肿瘤中呈现高表达，包括:子宫内膜癌［6］、肝细胞癌［7］、肺癌［8］、成神经管细胞瘤［9］、宫颈癌［10］等，其可能成为许多肿瘤基因治疗中的分子靶点［11］。前期我们的体外研究提示，stathmin 在胃癌SGC－7901 细胞中高表达，干扰其表达后能明显抑制胃癌SGC－7901 细胞的增殖、诱导细胞周期静止和细胞凋亡。因此，为进一步证实stathmin 在胃癌体内发生发展中的可能作用机制，我们建立胃癌细胞裸鼠移植瘤模型，从体内水平研究其表达下调对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，分析其可能的分子机制，为以stathmin 为靶点的胃癌基因治疗提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌细胞株SGC－7901 购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。RPMI－1640 培养基和胰蛋白酶购自Gibco;胎牛血清购自杭州四季青生物公司;Ki－67、stathmin、Bcl－2 和Bax 抗体以及stathmin siRNA(sc－36127)和对照siRNA(sc－37007)均购自Santa Cruz;SP 免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒和总蛋白提取试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

2 方法

2.1 胃癌SGC－7901 细胞培养 人胃癌细胞株SGC－7901 细胞在含有10%胎牛血清、1 ×105U/L青霉素和100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液中生长，并置于37 ℃、5% CO2相对饱和湿度的培养箱中培养。选取处于对数生长期的细胞用于以下各实验。

2.2 胃癌SGC－7901 细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立及实验分组 4 ～6 周鼠龄BALB/c 雌性裸鼠，重18 ～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物在河南省实验动物中心无菌空气层流内饲养。取处于对数生长期的胃癌细胞株SGC－7901 细胞，用胰酶消化，PBS 调整细胞悬液密度至5×1010/L。在裸鼠背部一侧皮下接种0.1 mL 细胞悬液，1 周后开始腹腔接种治疗。随机将15 只裸鼠分成3 组，每组5 只。3 组动物分别为PBS 组(接种PBS，隔天1 次)、对照siRNA 组(接种对照siRNA，终浓度为100 nmol/L，隔天1 次)和stathmin siRNA 组(接种stathmin siRNA，终浓度为100 nmol/L，隔天1次)。共治疗14 d，接种7 次。

2.3 移植瘤体积及体积抑瘤率的计算 从腹腔接种治疗开始，每隔1 d 用游标卡尺精确测量肿瘤的长径a(mm)和短径b(mm)，利用公式V(mm3)=ab2/2计算肿瘤体积。治疗2 周后处死小鼠，取出肿瘤组织，称重，并绘制各组肿瘤生长曲线。

2.4 免疫组织化学检测Ki－67 的表达 肿瘤组织经40 g/L 甲醛固定，石蜡包埋、4 ～6 μm 连续切片，采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶(SP)法检测。详细步骤严格按SP 试剂盒说明操作，在随机选取40 个视野中，Ki－67 阳性细胞数与总细胞数的比率即为增殖指数。

2.5 TUNEL 原位检测细胞凋亡 将取出的肿瘤组织进行固定、石蜡包埋及按4 μm 厚切片，然后按TUNEL 检测试剂盒说明书操作，检测肿瘤组织中的细胞凋亡情况。每张切片随机选取5 个视野(×200)，计数500 个细胞中TUNEL 阳性细胞数。背景无颜色，以细胞核内着棕黄色颗粒为TUNEL 阳性细胞。

2.6 Western blotting 检测蛋白表达 分别取3 组胃癌裸鼠移植瘤20 mg 组织，加入100 μL 蛋白裂解液，然后12 000 ×g 离心30 min 取上清液，并测定蛋白浓度。采用10% SDS－PAGE 方法进行蛋白分离，蛋白上样量为每泳道50 μg。电泳后将目的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入1∶200 稀释的stathmin、Bcl－2 和Bax 的抗体，4℃反应过夜。洗膜后，加入1∶5 000 稀释的Ⅱ抗，室温反应1 h，暗室曝光。结果用Image－Pro Plus 5.0软件分析目的蛋白的相对表达量。

3 统计学处理

结 果

1 Stathmin 在胃癌裸鼠移植瘤中的表达

转染stathmin siRNA 后瘤体中stathmin 蛋白的表达显著低于PBS 组和对照siRNA 组(P ＜0.05)，PBS 组和对照siRNA 组之间stathmin 蛋白表达无显著差异(P ＞0.05)，见图1。

Figure 1. Western blotting analysis for expression of stathmin protein in the 3 groups. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs PBS and control siRNA.图1 Western blotting 分析3 组裸鼠肿瘤组织中stathmin蛋白的表达

2 Stathmin siRNA 对胃癌SGC－7901 细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响

在裸鼠皮下注射胃癌SGC－7901 细胞成瘤后，分别注射PBS、对照siRNA 和stathmin siRNA 后，发现注射stathmin siRNA 后瘤体体积明显小于PBS 组和对照siRNA 组，见图2。实验结束后剥离瘤体并称重，stathmin siRNA 组中瘤体的重量［(0.46 ±0.11)g］明显小于PBS 组［(1.80 ±0.28)g］和对照siRNA组［(1.66 ±0.33)g］(P ＜0.05)，PBS 组和对照siRNA 组之间无统计学意义(P ＞0.05)。

Figure 2. The status of tumor growth in nude mice after treatment with stathmin siRNA.图2 Stathmin siRNA 治疗后裸鼠移植瘤的生长情况

3 Stathmin siRNA 抑制胃癌裸鼠移植瘤的增殖

各组裸鼠在治疗期间其瘤体的体积不断增大，但stathmin siRNA 组裸鼠移植瘤瘤体生长缓慢，第5 d 开始显著小于PBS 组和对照siRNA 组，组间比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，PBS 组和对照siRNA组之间无统计学意义(P ＞0.05)，见图3。

Figure 3. Growth curves of nude mouse transplanted tumors in the 3 groups. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs PBS group and control siRNA group.图3 3 组裸鼠瘤体的生长曲线

4 增殖抗原Ki－67 表达的检测

Stathmin siRNA 组中Ki－67 的染色强度明显低于PBS 组和对照siRNA 组，见图4。随机选取40 个视野，stathmin siRNA 组的细胞增殖指数(17.23%±2.91%)显著低于PBS 组(78.68%±4.31%)和对照siRNA 组(74.56%±4.58%)(P ＜0.05)。

5 TUNEL 检测胃癌裸鼠移植瘤细胞的凋亡

与PBS 组和对照siRNA 组相比，stathmin siRNA 组中凋亡细胞数明显增加，见图5。以随机选取的视野计数，stathmin siRNA 组的细胞凋亡数(85±13)明显高于PBS 组(18±5)和对照siRNA 组(16±6)(P ＜0.05)。

Figure 4. The result of immunohistochemical staining of Ki－67 protein(×200).图4 Ki－67 蛋白的免疫组织化学染色结果

Figure 5. Cell apoptosis detected by TUNEL in the 3 groups(×200).图5 TUNEL 检测3 组裸鼠肿瘤组织细胞的凋亡

6 Western blotting 检测Bcl－2 和Bax 蛋白的表达

与PBS 组和对照siRNA 组相比，stathmin siRNA组中Bcl－2 蛋白的表达明显下调，而Bax 蛋白的表达显著上调，且差异均具有统计学意义(P ＜0.05)，见图6。

讨 论

微管解聚蛋白stathmin 是从淋巴瘤中筛选出的特征性基因表达产物，其基因主要定位于人染色体1p35 ～36.1 上［12］。近年来，随着人们对细胞骨架，特别对微管蛋白、微管及纺锤体在细胞分裂和增殖中作用的不断探索和研究，才逐渐认识到stathmin 蛋白作为细胞信号转导分子在细胞周期和细胞凋亡，尤其在恶性肿瘤发生、发展中的重要作用。目前研究较为深入的是stathmin 在前列腺癌和骨肉瘤细胞中作用［4，13］。此外，在胃癌中发现stathmin 呈现高表达［14］，但目前关于stathmin 在胃癌细胞体内的分子作用机制还不清楚，为进一步从体内探讨stathmin可能的分子作用机制，本研究试图通过从体内下调stathmin 的表达来探讨其在胃癌发生发展中的作用。

Figure 6. Western blotting analysis for expressions of Bcl－2 and Bax proteins in the 3 groups. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs PBS and control siRNA.图6 Western blotting 分析3 组裸鼠肿瘤组织中Bcl－2 和Bax 蛋白的表达

本研究首先通过裸鼠皮下接种胃癌SGC－7901细胞，初步成功建立了胃癌的裸鼠移植瘤模型，并利用stathmin siRNA 进行治疗后发现其能明显抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长，并伴随着stathmin 蛋白表达的显著降低，提示stathmin siRNA 在裸鼠体内具有明显抑制stathmin 蛋白表达的作用。众所周知，Ki－67抗原是一种与细胞增殖特异相关的核抗原。Ki－67在细胞周期的各个时相中表达，但在静止细胞中不表达［15］。有研究表明，Ki－67 增殖指数高低与许多肿瘤的增殖、分化程度、侵袭转移以及预后密切相关［16］，因此也能作为某些恶性肿瘤预后的重要参考指标之一。为了进一步阐明stathmin siRNA 介导的胃癌裸鼠移植瘤增殖的抑制效应，我们检测与增殖相关的Ki－67 抗原的表达，发现stathmin siRNA 组的细胞增殖指数明显低于PBS 组和对照siRNA 组(P ＜0.05)，提示stathmin siRNA 能明显抑制胃癌裸鼠移植瘤的增殖，但具体的分子作用机制还有待于进一步探讨。

研究显示，利用siRNA 靶向作用于stathmin 能在体内外增强三氧化二砷引发的宫颈癌细胞凋亡，并与PI3K 信号转导途径密切相关［17］。Mistry 等［18］研究发现利用重组腺病毒下调前列腺癌LNCaP 细胞中stathmin 的表达能促使细胞发生凋亡。上述研究表明stathmin 在肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用，是否该作用能扩展到胃癌细胞?因此我们利用TUNEL检测发现stathmin siRNA 组的细胞凋亡数明显高于PBS 组和对照siRNA 组(P ＜0. 05)，利用Western blotting 方法分析胃癌裸鼠移植瘤中与细胞凋亡密切相关的蛋白Bcl－2 和Bax 的表达，发现stathmin siRNA 组中抑凋亡蛋白Bcl－2 的表达显著下调，而Bax蛋白表达明显升高，表明stathmin siRNA 介导的胃癌裸鼠移植瘤细胞凋亡可能与Bcl－2 表达下降和Bax表达升高密切相关。

总之，stathmin 表达下调能明显抑制胃癌裸鼠移植瘤的增殖和诱导细胞凋亡。上述研究为以stathmin 为靶点的胃癌基因治疗奠定了坚实的基础。

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