微管及其靶向制剂在骨肉瘤细胞凋亡中的研究进展

韩乐 许彪

作者单位：650500 昆明 昆明医科大学附属口腔医院口腔颌面外科

骨肉瘤（osteosarcoma）亦称成骨源性肉瘤，是儿童和青少年常见的原发性恶性肿瘤之一［1］，具有较高的局部浸润性和早期系统性转移倾向。骨肉瘤一般呈进行性膨胀生长，影像学检查可见不同程度、不同性质的骨质破坏，传统手术治疗5年生存率为20%左右，预后较差［2-3］。研究发现，骨肉瘤细胞分裂间期细胞质微管结构破坏、微管组装缺陷，与正常细胞质的内微管变化差异明显［4］，与骨肉瘤细胞分裂增殖和扩散转移密切相关。微管靶向制剂是一类通过促进或抑制微管蛋白聚合而干扰肿瘤细胞有丝分裂和促进细胞凋亡的靶向药物，药效高、毒性低［5］。目前，微管靶向制剂作为一种微管干扰药物已广泛用于骨肉瘤治疗，且已取得肯定的成效。本文对微管及其靶向制剂与骨肉瘤细胞凋亡关系的研究进展作一综述。

1 微管概述

微管分布于所有真核生物中，直径为22～25 nm，内径为10～15 nm，管壁厚度约为5 nm，是由α和β微管蛋白异二聚体构建而成的不分支中空纤维管状结构［6］，可组配成单微管（常见于细胞质和神经元）、二联微管（常见于纤毛和鞭毛）和三联微管（常见于基体和中心粒），其中分散于细胞质中的微管可作为细胞骨架系统成分。微管在细胞中呈网状或束状分布，且可与其他蛋白共同组装成基粒、纺锤体、鞭毛、纤毛、轴突等结构。α微管蛋白和β微管蛋白是高度保守的真核蛋白质，也是微管装配的基本亚基单位，二者装配形成的二聚体上具有一个秋水仙碱结合位点和一个长春花碱结合位点，可专一性地与秋水仙碱及长春花碱等微管靶向制剂结合，发挥干扰细胞分裂的作用［7］。微管的生物结构、空间排列和动态变化均受微管相关蛋白调控［8］。微管并非一成不变，微管末端可通过α/β-tubulin异二聚体的掺入和去除完成持续的生长和解聚过程，在细胞有丝分裂中可从相对稳定的界面排列转变为高度动态的双极纺锤体。此外，微管还可经生长、收缩和静息三个阶段组装成束状细丝排列，每个阶段中的动态不稳定结构对细胞分裂周期S期（DNA合成期）和G2期（DNA合成后期）过程中微管蛋白的大量合成具有重要意义［9-10］。有研究发现微管及其相关蛋白的动态变化为细胞运动提供了主要动力，是细胞质——细胞核运输微管所必需的［11］。研究表明，微管与肌动蛋白细胞骨架之间的相互作用可促进细胞对称性破坏，使细胞极化而发生分裂、形态改变和迁移，对驱动肿瘤细胞转移具有重要意义［12］。此外，微管作为一种重要的细胞骨架蛋白，可使肿瘤细胞周期阻滞于细胞分裂期并诱导其凋亡，是肿瘤治疗的重要靶点［13］。

2 微管与骨肉瘤细胞凋亡

细胞凋亡是一种基因编程的能量依赖性细胞死亡过程。细胞凋亡期间细胞骨架积极参与垂死细胞的特征性形态重排，而微管与中间丝在细胞凋亡的早期阶段被解聚［14］，解聚后的微管蛋白经重组装可形成纺锤体从而介导染色体运动。染色体分离需在着丝粒上组装动粒以介导与纺锤体微管的相互作用并控制细胞周期进展。SONG等［15］认为微管和微管蛋白的翻译后修饰可导致微管多样性并影响微管的装配动力学，从而影响细胞周期。微管具有高度复杂的不稳定性动力学行为，即在一定体外培养条件下，α、β微管蛋白二聚体的浓度必须在临界浓度以上二聚体才能聚合为微管，当浓度低于临界浓度时，微管即解聚为二聚体，且单一微管一直处于增长和缩短两个阶段［16］。细胞微管动力学的上述显著变化表征了细胞凋亡执行阶段中微管的动态不稳定现象。微管在细胞分裂前期形成纺锤体进而牵引染色体向细胞两极移动，从而实现细胞增殖，细胞分裂完成后微管最终形成膜结合外凋亡小体被吞噬降解［17］。研究表明，组成微管的微管蛋白是多种小分子天然化合物的靶标，促进或抑制微管蛋白解聚均可能导致细胞周期停滞和细胞凋亡［18］。骨肉瘤细胞与正常成骨细胞相比具有更高含量的微管纤维，而微管纤维与细胞凋亡、细胞周期等密切相关。有研究发现，微管诱导的骨肉瘤细胞活力降低可能通过激活原癌基因Bcl-2磷酸化，使抗细胞凋亡蛋白Bcl-2表达减少而细胞凋亡蛋白Bax表达增加，致使Bax与Bcl-2比值升高而进一步引起线粒体细胞色素C释放和激活caspase-9/-3依赖的凋亡途径，导致骨肉瘤细胞大量阻滞于G2/M期，诱导细胞凋亡，从而抑制骨肉瘤细胞生长和侵袭，而下调微管和微管蛋白表达则可阻碍骨肉瘤细胞的有丝分裂并使其凋亡［19］。由此可见，微管在骨肉瘤细胞的线粒体凋亡途径中发挥重要作用，但其诱导细胞凋亡的确切机制仍需进一步研究。

3 微管靶向制剂与骨肉瘤治疗

美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）骨肿瘤临床实践指南指出，目前国际上公认的骨肉瘤有效的治疗方法主要是原发灶扩大手术切除及术后辅助化疗。但多年以来传统化疗药物的疗效并未提升，且骨肉瘤尚无理想的早期诊断和预后监测分子标志物［20］。微管作为真核细胞内的骨架蛋白直接参与了肿瘤细胞的有丝分裂，其靶向制剂可通过抑制微管聚合（促解聚）或抑制微管解聚（促聚合）作用于微管蛋白，导致肿瘤细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤生长。根据作用机制的不同，微管靶向制剂可分为微管蛋白解聚剂（如秋水碱类、长春碱类）和微管蛋白聚合剂（如紫杉醇类）。目前应用于骨肉瘤的新型辅助化疗的微管靶向制剂主要为秋水碱类、长春碱类和紫杉醇类。

3.1 微管蛋白解聚剂

微管蛋白解聚剂是一种抑制微管聚合的微管蛋白活性抑制剂，主要包括秋水仙碱及其相关化合物（如角秋水仙碱、异秋水仙碱类似物）和长春花碱及其类似物（如长春地辛、长春瑞滨等）。研究表明秋水仙碱、长春花碱等微管抑制剂可分别作用于秋水仙碱位点和长春碱位点［21］，从而干扰细胞分裂。

3.1.1 秋水仙碱 秋水仙碱是从百合科植物秋水仙中提取的一种天然化合物，可与微管相互作用并破坏纺锤体抗有丝分裂活性，从而阻止细胞生长。体外细胞实验研究发现，人骨肉瘤细胞系MG63暴露于至少一个细胞周期的秋水仙碱后，细胞凋亡率明显升高，且细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bcl-X（L）的表达亦升高［22］，说明秋水仙碱能够诱导骨肉瘤细胞凋亡从而使其生长停滞。另有研究［23］发现秋水仙碱介导的细胞凋亡微管网络重组可导致细胞膜通透性增加和继发性坏死，微管细胞骨架的重构在维持细胞凋亡过程中的质膜完整性发挥重要作用。秋水仙碱作为一种高效微管靶向药物，能阻断细胞周期于G2/M期并诱发细胞凋亡，抑制微管形成而发挥抗细胞增殖作用，可作为开发潜在肿瘤药物的先导化合物［24］。然而秋水仙碱在杀伤肿瘤细胞的同时亦可对机体正常细胞产生较强的毒性，可导致机体发生如呕吐、腹泻、肝功能异常、肾脏损害、骨髓抑制等较严重的毒副反应［25］。此外，有研究发现，秋水仙碱和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤联合可以强烈阻碍纺锤体形成并诱导肿瘤细胞凋亡，且对正常成纤维细胞的毒性显著降低［26］。另有研究发现，联合用药或小剂量应用可明显降低秋水仙碱毒副反应［27］，因此秋水仙碱仍具有十分广阔的临床应用前景。

3.1.2 ABT-751 微管是骨肉瘤治疗中最有吸引力和有效的靶标之一，然而影响微管动态药物因其化学抗性和毒性在临床应用中受限，因此开发靶向微管的新型试剂尤为必要。ABT-751是秋水仙碱结合位点的新型抗有丝分裂剂，也是第一个被发现具有抗有丝分裂活性的磺胺类药物，可通过抑制微管蛋白聚合，破坏骨肉瘤细胞有丝分裂过程中的纺锤体结构，使DNA损伤、线粒体膜电位崩溃并将细胞周期阻滞于G2/M期，进而导致细胞凋亡［28-29］。ABT-751的Ⅰ期临床试验结果显示，4例儿童骨肉瘤患者口服ABT-751 12周后，肿瘤直径明显缩小，ABT-751抗肿瘤细胞增殖活性作用显著［30］。可见ABT-751在骨肉瘤治疗中取得了良好疗效，其作为一种新型抗微管蛋白药物在今后骨肉瘤化疗中具有潜在的应用价值。

3.1.3 长春瑞滨 长春瑞滨是一种长春花碱半合成衍生物，可通过干扰微管蛋白的聚合使细胞在有丝分裂过程中微管形成受阻，从而发挥广谱抗肿瘤活性，毒性较低。RONCUZZI等［31］研究发现，长春瑞滨在人骨肉瘤细胞株HOS和MG-63中具有抑制细胞生长并诱导其凋亡的作用，且生长抑制作用呈显著的剂量和时间依赖性，其抗肿瘤活性的主要机制可能是通过抑制纺锤体微管动力学，从而阻断有丝分裂进程而导致骨肉瘤细胞凋亡。说明长春瑞滨在体外人骨肉瘤中具有抗增殖作用，有望成为新的抗人骨肉瘤化疗药物。

3.2 微管蛋白聚合剂

微管蛋白聚合剂是抑制微管解聚的一类药物，可通过促进微管蛋白聚合形成微管聚合物，阻断细胞分裂周期的G2期和M期干扰细胞分裂而导致细胞凋亡，主要包括紫杉醇及其类似物。目前以紫杉醇为代表的微管蛋白聚合剂对骨肉瘤表现出良好的抗肿瘤活性。

3.2.1 紫杉醇 紫杉醇是一种从短叶紫杉树皮中提取的具有抗肿瘤活性的自然产物，通过稳定有丝分裂纺锤体的微管介导其活性。紫杉醇作为一种新型抗微管药物，能特异性地结合到微管的β位上，使微管聚合成团块和束状，并通过阻止多聚化过程而使微管蛋白稳定地抑制细胞有丝分裂［32］。有研究发现，紫杉醇对人骨肉瘤细胞的抗肿瘤效应分子机制不仅是通过聚合β-微管蛋白阻断有丝分裂阶段诱导细胞凋亡，还可能通过缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α 途径诱导自噬［33］。SPINA 等［34］研究发现，紫杉醇联合无机磷酸盐对人骨肉瘤细胞系U20S增殖和侵袭的抑制作用显著；二者联合用药具有协同效应且对正常组织表现为低毒反应。紫杉醇作为微管蛋白聚合剂联合无机磷酸盐的抗骨肉瘤作用，为临床骨肉瘤辅助化疗提供了新的途径，未来骨肉瘤的联合化学疗法将会受到越来越多的关注。

3.2.2 多西紫杉醇 多西紫杉醇是一类结构复杂的紫杉烷类化合物，结构特点与紫杉醇相似，多西紫杉醇的抗肿瘤活性是紫杉醇的1.3～12.0倍，对微管结合部位的亲和力是紫杉醇的2倍［35］。多西紫杉醇主要作用于构成细胞骨架的微管网络，通过促进微管聚合并稳定微管结构，阻止其解聚成亚单位，进而影响微管聚合与解聚的动态平衡，形成稳定的非功能性微管，从而破坏细胞有丝分裂和细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡［36］。JIN 等［37］研究发现，多西紫杉醇可显著抑制骨肉瘤细胞系HOS 8603的增殖，并诱导细胞凋亡，细胞凋亡率表现出明显的剂量依赖性。此外，陶海等［38］报道多西紫杉醇联合顺铂用药可使人骨肉瘤细胞HOS-8603的细胞凋亡数大量增加并形成凋亡小体，与单用顺铂时比较，联合用药诱导细胞凋亡效应更显著且随着两药作用时间延长而愈加显著；此外两者联合用药还可使荷瘤裸鼠肿瘤体积显著下降，且毒副反应未增加。可见，多西紫杉醇联合顺铂用药对骨肉瘤化疗效果更佳，为骨肉瘤化疗提供了新的思路。综上认为，紫杉醇类化合物在骨肉瘤细胞的凋亡过程中发挥了重要的作用，具有良好的临床应用前景。

4 小结

骨肉瘤治疗方法主要为手术结合化疗，但化疗耐药性常导致化疗失败［39］，是骨肉瘤临床治疗面临的一大难题。目前研究认为微管可诱导骨肉瘤细胞凋亡，其靶向制剂秋水碱类、长春碱类和紫杉醇类等已广泛应用于骨肉瘤治疗，且取得较好的临床疗效，尤其以紫杉醇为代表的微管蛋白聚合剂在骨肉瘤治疗中表现出良好的抗肿瘤活性。但是微管靶向制剂的毒副作用亦不容小觑，同时多药耐药、肿瘤复发和肿瘤转移等问题，使其临床推广应用受到一定限制。因此，进一步研发新型微管靶向制剂，尝试微管靶向制剂与其他药物联合，有望提高骨肉瘤的治疗疗效及降低毒副反应，增强化疗敏感性，这也将是未来抗骨肉瘤药物研发的新的方向。