4种试剂盒提取病理组织切片中裂头蚴DNA效果的比较

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裂头蚴病是由猬迭宫绦虫的幼虫寄生人体所致的人兽共患病[1]。迄今，我国已有1 000多例报告，来自于全国27个省、市、自治区[2]。人体裂头蚴病的临床表现因寄生部位不同而异，诊断主要依赖于局部发现裂头蚴或虫体的残端组织[3]，因裂头蚴病常表现为慢性感染过程且临床症状不典型，临床上对裂头蚴结构的认识不足给诊断带来困扰。为提高裂头蚴病的病原诊断水平，近年来，人们开展了裂头蚴病的分子病理诊断研究[4-6]。从含有虫体残端组织的切片中提取并分析其结构，一定程度上弥补了普通病原学诊断的不足，提高该病的检出率。而在分子病理诊断中，提取病理切片中的DNA是关键步骤[7-11]。目前DNA提取试剂盒层出不穷，而不同的试剂盒提取的效果及速度等存在很大差异。对于不同目的和条件的实验，需要选择不同的试剂盒以满足后续的分析检测[12-15]。

考虑到裂头蚴病临床类型特点，人工建立小鼠皮下肌肉裂头蚴病动物模型，取有裂头蚴寄生的皮下肌肉组织块制作病理组织切片[16]，用4种商品试剂盒平行提取切片中裂头蚴DNA，比较提取效果，为裂头蚴病临床分子病理诊断选用试剂盒提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验标本来源 裂头蚴：采集贵州安顺等地的野生王锦蛇，自蛇体内检获猬裂头蚴，并经形态学鉴定确认虫种。检获的裂头蚴用于小鼠感染。

1.1.2实验动物 昆明小鼠30只，20～25 g，雌雄各半，引自贵州医科大学动物实验中心，清洁级(合格证号：SCXK(黔)2012-0001)。

1.1.3DNA提取试剂盒 试剂盒1(QIAamp DNA FFPE Tissue kit)购自广州健伦生物科技有限公司(德国QIAGEN公司)；试剂盒2购自大连宝生物有限公司；试剂盒3购自北京庄盟国际生物有限公司；试剂盒4购自康为世纪有限公司。

1.1.4引物序列 根据目的基因，参考Jeon等[17]的文献设计cox1基因引物。引物由上海英潍捷基贸易有限公司进行合成。序列如下：

cox1-F：5′-CGGCTTTTTTTGATCCTTTGG-GTG-3′

cox1-R：5′-GTATCATATGAACAACCTAA-TTTAC-3′

1.2 方法

1.2.1小鼠感染模型的建立及病理组织切片的制备 将小鼠分为实验组25只和对照组5只。用蛇源裂头蚴经口服法感染实验组小鼠(5条/只)，对照组不做任何处理，相同条件饲养。2周后对感染小鼠进行解剖，取含裂头蚴寄生的皮下肌肉组织(有虫组织)20块及健康小鼠相对应的皮下肌肉组织(对照组织)5块，每块大小为1 cm3。用10%甲醛固定，石蜡包埋，常规方法制成组织白片及HE染色片，切片厚度为7.0 μm。

1.2.2DNA的提取 用4种商品试剂盒平行提取有虫组织白片或HE染色片(5片)中的DNA，提取的方法和条件按试剂盒提供的操作流程进行。比较提取DNA的数量与质量，所需时间及成本。DNA样本于-20 ℃保存备用。以改良蛋白酶K消化法(脱蜡时间3 h，蛋白酶K浓度为1 500 μg/mL，消化时间24 h)为对照，比较提取DNA的数量与质量，所需成本及时间，并将4种试剂盒提取的DNA作PCR扩增，观察不同试剂盒提取DNA的扩增效果。

1.2.3 目的基因作PCR扩增的条件

1.2.3.1PCR扩增反应体系 总体积为20 μL，DNA提取物 1 μL，2×Taq PCR Master Mix试剂10 μL，上、下游引物各1.5 μL，加双蒸水6 μL。

1.2.3.2PCR扩增程序 95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增时以双蒸水作阴性对照。

1.2.4DNA浓度、纯度及提取率的检测 取2 μL提取的DNA用紫外分光光度计读取DNA浓度和A260/A280比值(DNA纯度)。

2 结 果

2.1提取纯度及浓度的比较 用4种商品试剂盒平行提取裂头蚴有虫组织白片DNA，提取纯度及浓度效果为：试剂盒1=试剂盒2>试剂盒3>试剂盒4；用4种商品试剂盒平行提取有虫组织HE染色片的DNA，其提取纯度及浓度效果为：试剂盒1=试剂盒2>试剂盒3=试剂盒4；对4种试剂盒的成本及提取时间进行比较：试剂盒1的成本最高耗时较短，试剂盒2的成本较低耗时最短，试剂盒3的成本最低耗时也最长，试剂盒4的成本略高于试剂盒3，耗时相对较长(表1、2)。

表1 4种试剂盒提取有虫组织白片DNA浓度及纯度的情况
Tab.1 Concentration and purity of DNA by four different kits

试剂盒DNA纯度A260/A280DNA浓度(ng/μL)成本(元/μgDNA)提取时间改良蛋白酶K法1.850±0.048371.008±14.6212027 h试剂盒11.852±0.057373.858±24.65618530 min试剂盒21.814±0.001354.005±12.7279025 min试剂盒31.776±0.059ab314.005±12.727ab5526 h试剂盒41.664±0.107abcd304.998±15.046abcd563 hχ218.0681694.106P<0.01<0.01

注：在同一列数据，a：与改良蛋白酶K法相比P<0.01，b：与试剂盒1相比P<0.01，c：与试剂盒2相比P<0.01， d：与试剂盒3相比P<0.01。AOD：平均光密度值

表2 4种试剂盒提取有虫组织HE染色片DNA浓度及纯度的情况
Tab.2 Concentration and purity of DNA by four different kits

试剂盒DNA纯度A260/A280DNA浓度(ng/μL)成本(元/μgDNA)提取时间改良蛋白酶K法1.861±0.076318.082±14.7212027 h试剂盒11.863±0.001327.051±33.20918530 min试剂盒21.861±0.001317.051±13.2489025 min试剂盒31.669±0.017abc273.858±24.656abc5526 h试剂盒41.704±0.447abc274.998±15.046abc563 hχ210.1682 530.685P<0.05<0.01

注：在同一列数据，a：与改良蛋白酶K法相比P<0.01，b：与试剂盒1相比P<0.01，c：与试剂盒2相比P<0.01， d：与试剂盒3相比P<0.01。AOD：平均光密度值

2.2提取率的比较 随机抽取有虫组织15个样本，每份样本5片。用4种试剂盒进行DNA的提取,并与改良蛋白酶K法进行比较。改良蛋白酶K法的提取率为100%，而试剂盒1-4的提取率分别为100%、93.3%、80%及73.3%(表3)。

表3 4种试剂盒提取虫体组织白片样品DNA提取率
Tab.3 Extraction rate of DNA by four different kits

试剂盒样本数阳性数提取率(%)试剂盒11515100试剂盒2151493.3试剂盒3151280.0试剂盒4151173.3改良蛋白酶K法1515100

2.34种试剂盒与改良蛋白酶K消化法提取效果比较 用4种试剂盒及改良蛋白酶K消化法分别对有虫组织白片及HE染色片进行DNA提取，提取的DNA作PCR扩增。电泳结果均有150 bp特异条带出现在相位的位置上，试剂盒4的条带相对较暗(图1、2)。

M：DNA标准分子量；1-3：改良蛋白酶K法；4-6：试剂盒4提取结果；7-9：试剂盒3提取的结果；10-12：试剂盒2提取的结果；13-15：试剂盒1提取的结果；16-17：对照组织(改良蛋白酶K法)图1 4种试剂盒与改良蛋白酶K消化法提取白片效果的比较Fig.1 Comparison of the DNA extracted from white slices by four kits and modified proteinase K method

M：DNA标准分子量；1-2：改良蛋白酶K法；3-4：试剂盒4提取结果；5-6：试剂盒3提取的结果；7-8：试剂盒2提取的结果；9-10：试剂盒1提取的结果；11-12：对照组织(改良蛋白酶K法)图2 4种试剂盒与改良蛋白酶K消化法提取HE染色片效果的比较Fig.2 Comparison of the DNA extracted from HE stained slices by four kits and modified proteinase K method

3 讨 论

近年来有多种商业化的试剂盒可供提取石蜡包埋组织切片中的DNA。试剂盒操作简单规范深受用户喜欢，但不同的试剂盒，其提取DNA的浓度、纯度、提取率以及价格等仍存在很大差别。本实验选取四种试剂盒平行提取了裂头蚴石蜡包埋虫体组织白片和HE染色片的效果，对提取所需时间、提取的质量、提取率及价格等方面进行了比较，并用改良蛋白酶K法进行验证。

4种试剂盒提取的DNA纯度(A260/A280)均在正常范围，说明DNA既没有被过多破坏，也没掺入RAN、氯仿等杂质。经PCR扩增后在150 bp的位置出现相应的条带，提取效果均能满足实验要求。试剂盒1有脱蜡、裂解、加热、结合、洗涤和洗脱6步，操作过程时间较短组织裂解充分，DNA降解程度小，提取的DNA纯度、浓度均较高，但成本也最高。试剂盒2无需脱蜡，不接触有害溶剂，既安全又缩短了操作时间，但吸取DNA水层时易污染，较适合400 bp以下的DNA片段扩增，有一定的局限性。试剂盒3操作相对复杂需过夜，肉眼判断组织片变色情况易产生误差，且耗时最长，不适用于DNA的快速提取。试剂盒4不需过夜操作，耗时相对适中，但孵育温度高时间长易引起组织结构破坏，提取DNA的效果最差。改良蛋白酶K法提取的DNA也能达到要求，但耗时较长，需接触有害物质，不利于广泛推广使用。近年来，国产试剂盒的品质在不断提高，在某些方面甚至优于国外试剂盒。本实验的结果为临床的选择提供了实验依据。

实验仍存在不足，所用的病理标本均为小鼠模型标本，如能有相应的临床病人标本进行验证，将有利于提取条件的进一步完善，使裂头蚴病的分子病理诊断更进一步。