EPCAM、CD44 和CD24 在胃癌组织中的表达及其临床意义*

杨世斌， 肖隆斌， 许峰峰， 吴文辉， 李守智， 李明哲

(中山大学附属第一医院黄埔院区普外科，广东 广州510700)

上皮细胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)、白细胞分化抗原44 (cluster of differentiation 44，CD44)和白细胞分化抗原24 (cluster of differentiation 24，CD24)是不同肿瘤干细胞的表面标记。EPCAM+CD44+可作为结直肠癌干细胞的表面标记［1］。Takaishi 等［2］发现CD44+可作为胃癌干细胞的表面标记。胃癌AGS 细胞系中CD44+CD24+是胃癌干细胞的表面标记［3］，也有认为EPCAM+CD44+可作为胃 癌 干 细胞表面 标记［4］，EPCAM+CD44+CD24+可作为胰腺癌干细胞的表面标记［5］。目前尚无联合检测胃癌中以上指标的文献资料，本文联合检测EPCAM、CD44 和CD24 在胃癌组织中的表达，并分析其与临床病理特点及预后的关系。

材 料 和 方 法

1 一般资料

数据源于中山大学附属第一医院胃癌诊治中心数据库，剔除伴严重基础疾病的病人，选取2003 年5月至2004 年6 月胃癌95 例，同时取25 例癌旁正常黏膜组织作为阴性对照，均行手术治疗，未经术前放化疗。病理结果均由2 名高级别的病理医生做诊断。签署知情同意书。术后将病理标本蜡块行免疫组化检测，同时对95 例患者治疗情况进行预后分析。

2 主要试剂材料

兔抗人CD24 多克隆抗体购自ABGENT，兔抗人CD44 单克隆抗体购自EPITOMICS，兔抗人EPCAM多克隆抗体及抗体稀释液购自北京博奥森公司。二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒及缓冲稀释液、原液购自基因科技(上海)有限公司。

3 方法

选取已有病理诊断的胃癌石蜡块，以每张3 mm厚切片，置于63 ～65 ℃烤箱1 ～2 h。将切片浸于二甲苯中脱蜡3 次，每次5 min;100%、90%、80%、70%梯度乙醇洗2 次，每次3 min;蒸馏水洗3 min;将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92 ～98 ℃之间并持续10 ～15 min，室温下自然冷却;蒸馏水洗2 次，每次1 min;3%H2O2浸泡切片，室温静置10 min;或微波炉低火1 min;PBS 洗3 次，每次3 min;取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒，滴加Ⅰ抗(工作液)100 μL，37 ℃温箱孵育1 h;孵育完毕，用PBS 洗3 次，每次3 min;滴加Ⅱ抗100 μL，37 ℃温箱孵育30 min;PBS 洗3 次每次3 min;DAB 工作液显色1 ～5 min，在显微镜下控制显色程度，当显色合适时用蒸馏水冲洗终止反应;Mayer 苏木素复染3 min，蒸馏水冲洗3 ～5 min;各级浓度乙醇(70%～100%)脱水、二甲苯透明、封片胶封片、镜检。

判定原则及标准:(1)必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。(2)抗原表达必须在特定部位。不在抗原所在部位的阳性着色，一律不能视为阳性。(3)避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达。

4 统计学处理

数据应用SPSS 13.0 软件进行统计学处理，率的比较用χ2检验，多变量分析用Logistic 回归，累积生存率根据寿命表法计算，生存曲线用Kaplan－Meier法分析，多因素用Cox 回归分析，生存率比较用logrank 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 免疫组化结果

EPCAM 表达阳性56 例，阳性率58.95%;CD44表达阳性41 例，阳性率43.16%;CD24 表达阳性56例，阳性率58.95%。其中EPCAM+CD44+30 例，阳性率 31. 58%;EPCAM+CD24+45 例，阳 性 率47.37%;CD44+CD24+32 例，阳性率33. 68%;EPCAM+CD44+CD24+25 例，阳性率26.32%。阴性对照组这3 种蛋白的阳性率分别为16.00%、8.00%和20.00%，见图1。

2 95 例胃癌患者病例多因素Cox 回归分析

Figure 1. The expression of EPCAM，CD44 and CD24 in tumor tissues and normal gastric mucosae (immunohistochemical staining，×400).A，D，G:positive expression in gastric adenocarcinoma;B，E，H:negative expression in gastric adenocarcinoma;C，F，I:control group.Black arrows referred to positive staining，and the others referred to negative staining.图1 EPCAM、CD44 及CD24 在胃癌组织及正常黏膜中的表达

对95 例胃癌术后患者的资料进行Cox 回归分析，将所有因素纳入分析范围，结果显示对其生存率有影响的是腹水、盆结节、腹膜侵犯、EPCAM、CD44、三者皆阳性、分化和浸润程度，差异有统计学意义(P＜0.05)，而根治术式、组织学分型和肿瘤部位在显著性水平附近。如果患者合并腹水、盆腔转移结节、腹膜种植侵犯、低分化、EPCAM 及CD44 阳性或三指标阳性时相对危险度将明显增加，而CD24 阳性、印戒细胞癌、BORRMANN Ⅳ型和淋巴结转移时危险度分别增加55.4%、30.7%、54.3%、10.9%和30.6%，见表1。

3 临床病理指标的单因素分析结果

EPCAM 与年龄、肿瘤浸润深度和WHO 组织学分型有关;CD44 与BORRMANN 分型、WHO 组织学分型和CEA 值有关;CD24 与浸润深度、肿瘤位置、WHO 组织学分型和脏器侵犯有关;三者阳性与浸润深度、肿瘤位置和WHO 组织学分型有关，见表2。

4 与患者术后生存率分析比较

EPCAM 或CD44 阳性组的术后生存率较阴性组降低，生存时间缩短CD24 阳性组与阴性组相比差异无统计学意义。CD44+CD24+EPCAM－与EPCAMCD44－CD24－比较差异有统计学意义，其余双指标组无统计学意义。三指标阳性组与三指标阴性组生存率比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图2 ～8。

讨 论

本研究同时检测胃癌组织中的EPCAM、CD44 和CD24 阳性表达，结果显示EPCAM 表达率在58.95%(56/95)，而国内外学者报道比例在30% ～75%左右［6］。CD44 表达阳性率在43.16%(41/95)，而国内 外报道表达比率在19% ～90%不等［7－8］。CD24表达阳性率58.95%(56/95)，与EPCAM 一致，而此蛋白国内外报道在50% ～81%左右。

表1 95 例胃癌患者Cox 回归分析Table 1. Cox regression analysis in 95 gastric cancer patients

CD44 与多种肿瘤有关，有学者认为其在结直肠癌中表达高达90%以上，但是阳性组与阴性组在生存率上差异无统计学意义［9］，在小细胞肺癌中患者血清CD44S、CD44V6 水平明显高于肺良性疾病，可作为鉴别NSCLC 和肺良性疾病的辅助指标［10］。另有学者认为胃癌病例CD24 和CD44v6 表达阳性率明显高于癌旁组织和不同类型胃良性病变［11］，在胃癌表达阳性率是43.9%，阳性者化疗效果好［12］。本研究显示，CD44 与BORRMANN 分型和WHO 组织学分型和CEA 值有关。同样，Bektas 等［13］对93 例胃癌组织行CD24 免疫组化分析，认为CD24 表达阳性率在87%，与淋巴血管侵犯、浆膜浸润和TNM 分期及淋巴结转移有关。Chou 等［14］认为，CD24 在50%的胃癌细胞质中表达，与TNM 分期、浆膜侵犯和淋巴血管侵犯有关，10 年生存率明显下降。我们的资料认为CD24 与浸润深度、肿瘤位置、WHO 组织学分型和脏器侵犯有关(P ＜0.05)。同时我们认为EPCAM 与年龄、肿瘤浸润深度和WHO 组织学分型有关。年轻或年老、T4期及腺癌患者该指标阳性率

高(P ＜0.05)。EPCAM 与胃癌远处转移有较大关系，在远处转移、淋巴结转移及无转移的胃癌中表达率分别为90%、86%和58%［15］。另外，三指标阳性组与3 指标阴性组在侵润深度、肿瘤位置、WHO 组织学分型上差异有统计学意义。

表2 EPCAM、CD44 和CD24 在胃癌组织中的表达与临床病理资料之间的关系Table 2. Correlation between the clinicopathological features and the expression of EPCAM，CD44 and CD24

AC:adenocarcinoma;MC:mucinous carcinoma;SRCC:signet ring cell carcinoma.

Figure 2. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM expression (P ＜0.05).图2 胃癌中EPCAM 表达与Kaplan－Meier 生存率曲线

Figure 3. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD44 expression(P ＜0.01).图3 胃癌中CD44 表达与Kaplan－Meier 生存率曲线

Figure 4. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD24 expression (P ＞0.05).图4 胃癌中CD44 表达与Kaplan－Meier 生存率曲线

Figure 5. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM，CD44 and CD24 expression (P ＜0.05).图5 胃癌中EPCAM、CD44 和CD24 表达与Kaplan－Meier 生存率曲线

Figure 6. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM and CD44 expression(P ＞0.05).图6 胃癌中EPCAM 和CD44 表达与Kaplan－Meier 生存率曲线

Figure 7. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM and CD24 expression(P ＞0.05).图7 胃癌中EPCAM 和CD24 表达与Kaplan－Meier 生存率曲线

Figure 8. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD44 and CD24 expression(P ＜0.05).图8 胃癌中CD44 和CD24 表达与Kaplan－Meier 生存率曲线

本研究结果显示，CD44、CD24、EPCAM 在癌旁正常黏膜及肿瘤中均有不同程度表达，但癌旁正常黏膜表达较胃癌组织中低，说明从正常黏膜到癌的转变过程中三者表达发生了重要变化，可作为预判断瘤侵袭能力和预后的指标。CD24、EPCAM、三者阳性的表达与浸润深度有关，而且CD24 还与脏器侵犯有关。同时，三者均与组织学分型有关，多因素分析显示分化浸润程度是影响生存最重要的因素，进一步证实了它们与胃癌的浸润转移有密切的联系，对胃癌的预后判断有一定意义。CD44、CD24 及EPCAM 的表达可能存在着协同作用，或者存在一种机制将其联合起来，促进肿瘤细胞的浸润转移及预后，而且三者联合作用比任何一种黏附分子单独作用都更能促进肿瘤的浸润转移。EPCAM 与年龄有关，说明它可能与胃癌患者的生存时间缩短有关，年龄上的积累可能与肿瘤干细胞的形成有关。

我们结果显示，EPCAM、CD44 阳性组与阴性组的生存率差异有统计学意义，而CD24 阳性组与阴性组的生存率差异无统计学意义，这与Bektas 等［13］的结论不同，他们认为CD24 阳性者生存率增加。分析原因，CD44+资料中印戒细胞癌比例较其它两者高，故与EPCAM 一样，死亡率高。CD24－病例中T4 占69.23% (27/39)，BORRMANN Ⅲ～Ⅳ占82. 05%(32/39)，与CD24+组比较差异无统计学意义。

综上所述，联合检测EPCAM、CD44 和CD24 可作为胃癌的初筛实验，尤其对于胃腺癌有诊断价值，同时可指导针对性的手术治疗，有益于胃癌的综合治疗，提高生存率。

［1］ Dalerba P，Dylla SJ，Park IK，et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(24):10158－10163.

［2］ Takaishi S，Okumura T，Tu S，et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44［J］.Stem Cell，2009，27(5):1006－1020.

［3］ Zhang C，Li C，He FJ，et al. Identification of CD44+CD24+gastric cancer stem cells［J］.Cancer Res Clin Oncol，2011，137(11):1679－1686.

［4］ Han ME，Jeon TY，Hwang SH，et al. Cancer spheres from gastric cancer patients provide an ideal model system for cancer stem cell research［J］.Cell Mol Life Sci，2011，68(21):3589－3605.

［5］ Li C，Heidt DG，Dalerba P，et al.Identification of pancreatic cancer stem cell［J］. Cancer Res，2007，67(3):1030－1037.

［6］ Du W，Wang L，Cao S，et al. EPCAM is overexpressed in gastric cancer and its downregulation suppresses proliferation of gastric cancer［J］. J Cancer Res Clin Oncol，2009，135(9):1277－1285.

［7］ Ghaffarzadehgan K，Jafarzadeh M，Raziee HR，et al. Expression of cell adhesion molecule CD44 in gastric adenocarcinoma and its prognostic importance［J］. World J Gastroenterol，2008，14(41):6376－6381.

［8］ Wang DR，Chen GY，Liu XL，et al. CD44v6 in peripheral blood and bone marrow of patients with gastric cancer as micro－ metastasis［J］. World J Gastroenterol，2006，12(1):36－42.

［9］ 陈仕才，宋新明，陈志辉，等. CD133 和CD44 在结直肠癌细胞中的表达及其与患者5 年生存率的相关性分析［J］.中国病理生理杂志，2011，27(5):883－889.

［10］ 金可可，蒋仲荪，陈少贤，等. 非小细胞肺癌患者CD44及其变异体V6 的测定［J］.中国病理生理杂志，2001，17(11):1008－1092.

［11］ 姚宏亮，杨竹林，李永国. 胃良恶性病变组织中CD24和CD44v6 的表达及其意义［J］. 中国病理生理杂志，2008，24(8):1629－1631.

［12］ 王 芳，尹芳蕊，华云旗. CD44 和CD133 在胃癌组织中的表达及临床意义［J］.中国病理生理杂志，2010，26(10):2009－2010.

［13］ Bektas S，Bahadir B，Ucan BH，et al. CD24 and galectin－ 1 expressions in gastric adenocarcinoma and clinicopathologic significance［J］. Pathol Oncol Res，2010，16(4):569－577.

［14］ Chou YY，Jeng YM，Lee TT，et al. Cytoplasmic CD24 expression is a novel prognostic factor in diffuse－type gastric adenocarcinoma［J］. Ann Surg Oncol，2007，14(10):2748－2758.

［15］ Du W，Ji H，Cao S，et al.EPCAM:a potential antimetastatic target for gastric cancer［J］.Dig Dis Sci，2010，55(8):2165－2171.