光敏化促进姜黄素诱导人胃癌MGC－803 细胞凋亡*

2012-12-23旷焱平何博华王林静祝爱珍刘成成刘革修

中国病理生理杂志 2012年7期

旷焱平，陈垦△，何博华，王林静，祝爱珍，刘成成，刘革修

(广东药学院1护理学院，2临床学院，3公共卫生学院，广东广州510006;4暨南大学医学院血液学研究所，广东广州510632)

姜黄素是活血药中药姜黄的主要成分，属于天然酚类抗氧化剂，其抗肿瘤作用日益引起人们的重视，已成为肿瘤预防和治疗的一个研究热点，美国国立肿瘤研究所已将其列为第3 代癌化学预防药。姜黄素通过诱导细胞凋亡达到抗肿瘤作用已被不少文献报道［1－2］。而且陈瑞川等［3］首次发现姜黄素在光照条件下可降低姜黄素诱导人胃腺癌MGC－803 细胞凋亡所需要的浓度，即15 W、光距20 cm 的日光灯照射下有促进姜黄素诱导细胞凋亡的效应，但是没有研究其机制。本研究以人胃腺癌MGC－803 细胞为研究对象，探讨了激光照射姜黄素(光敏化)诱导细胞凋亡及其机制。

材料和方法

1 材料

1.1 材料人胃腺癌MGC－803 细胞株(中山大学动物实验中心提供)，姜黄素(Sigma)，小牛血清和RPMI－1640 培养液(华美公司)。

1.2 细胞培养及药物处理人胃腺癌MGC－803细胞于含10%小牛血清、1 ×105U/L 青霉素及100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液、5%CO2、37 ℃培养传代。细胞按(1 ～2)×108/L 接种，37 ℃培养24 h 后按实验要求加入一定浓度的姜黄素，对照组加同量的溶剂，继续培养24 h 后即收集细胞。姜黄素0.1842 g 先用100 μL 二甲基亚砜(DMSO)溶解后，用无水乙醇定容至50 mL，即为10 mmol/L 姜黄素母液，分装0.5 mL/管，－20 ℃避光冻存。应用时以细胞培养液稀释至所需浓度。

2 方法

2.1 姜黄素吸收光谱测定配成浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μmol/L 姜黄素溶液，用Lambda 35 紫外/可见分光光度计(Perkin－Elmer)测定姜黄素吸收光谱(波长范围200 ～1 100 nm)，反复测定10 个样本各10 次，统计、拟合光谱曲线，确定光谱峰值所在波长(即可活化姜黄素，发挥其光敏活性的最佳波长)为本实验照射所用激光的波长。

2.2 MTT 法测定姜黄素对细胞生长的抑制作用

取对数生长期MGC－803 细胞，调整密度为2 ×108/L，每孔100 μL，姜黄素浓度为1、5、10、15、20 μmol/L，设3 个复孔，同时设DMSO 对照孔和不加细胞的调零孔，5% CO2、饱和湿度、37 ℃孵育72 h，加入MTT 试剂孵育3 h 后在全自动酶标仪上检测各孔的吸光度值(测量波长490 nm)。癌细胞生长抑制率(%)= (1－实验组平均吸光度值/空白组平均吸光度值)×100%。根据实验结果数据计算得IC50=10.9 μmol/L，以此确定后续实验姜黄素浓度为5 μmol/L。

2.3 光敏化促进姜黄素对癌细胞的作用观察实验分组:空白组、单纯姜黄素组、单纯激光照射(pure light)组和姜黄素+激光照射(光动力学治疗，photodynamic therapy，PDT)组。单纯光照组和姜黄素+PDT 组都采用功率和波长都连续可调的全固态连续钛宝石激光器(COHERENT，model:899－05)照射。单纯姜黄素组为5 μmol/L 姜黄素。姜黄素+ PDT组为5 μmol/L 姜黄素和用可发挥姜黄素光敏活性的波长的激光照射(波长为405 nm 蓝光，照射时间为15 min，照射剂量为40 J/cm2)。空白组和单纯姜黄素组则不用上述波长的激光照射。

2.4 Annexin V－PI 双染测定细胞凋亡取对数生长的MGC－803 细胞，每孔2.5 ×105个细胞接种至6 孔板内，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h 后分组并进行相关处理，继续培养48 h 后用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞，加入200 μL 试剂盒提供的结合缓冲液，重悬细胞后，加入5 μL Annexin－Ⅴ和10μL PI 染料后充分混匀，避光反应15 min 后进行流式细胞仪检测。含有“亚二倍体”DNA 的细胞被认为是凋亡细胞，并测凋亡细胞比率。其结果用ModFitLT for Mac 3.0 软件分析。

2.5 Hoechst 33258 荧光染色观察细胞核形态将MGC－803 细胞接种于含盖玻片的培养板中进行细胞爬片，70%汇合时，分组进行药物处理，48 h 后弃培养液，PBS 清洗2 遍，加入0.5 mL/well 4%多聚甲醛固定液固定20 min，PBS 清洗2 遍，加入Hoechst 33258 染色液染色20 min，PBS 洗2 遍，每次5 min，自然干燥后用中性甘油封片. 荧光显微镜下观察细胞核形态并拍照。

2.6 流式细胞仪检测线粒体膜电位、活性氧和细胞内Ca2+取对数生长期细胞，以每孔5 ×104个细胞接种至12 孔板，贴壁培养12 h 后进行处理，之后6 h、12 h、24 h 时收集细胞，PBS 洗涤2 遍。500 μL JC－1(10 mg/L)重悬细胞检测线粒体膜电位，500 μL DCFH－DA (5 μmol/L)重悬细胞检测细胞产生的活性氧，10 μmol/L 荧光染料Fluo－3AM 检测细胞内Ca2+浓度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式细胞仪检测线粒体膜电位、活性氧和细胞内Ca2+。

2.7 比色法检测caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性取对数生长期细胞，以每孔5 ×104个细胞的密度接种至12 孔板，贴壁培养12 h 后进行处理，之后6、12、24 h，按照试剂盒说明收集细胞，预冷PBS 洗涤后重悬于细胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃、10 000 × g 离心10min，取上清加入显色底物(caspase－3 底物Ac－DEVD－pNA、caspase－8 底物Ac－IETD－pNA 和caspase－9 底物Ac－LEHD－pNA)，终浓度50 μL/L，均匀混合并加入到96 孔板中，每组5 个复孔，避光孵育4 h，酶标仪在波长405 nm 处检测A 值。

2.8 Western blotting 检测细胞色素C、Bcl－2、Bax和热休克蛋白70(heat－shock protein 70，HSP70)表达水平取对数生长期细胞，贴壁培养12 h 后进行处理，之后48 h 时收集细胞PBS 洗2 遍，加入蛋白抽提液抽提总蛋白;细胞色素C 测定是按试剂盒抽提胞浆及线粒体蛋白。取蛋白50 μg，经10% SDS－PAGE 电泳分离，常规转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，以β－actin 作内参照，1∶5 000 稀释的HRP 标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，化学发光法分析蛋白表达。

3 统计学处理

采用SPSS 15.0 for Windows 统计学软件进行统计。率的比较采用χ2检验，计量资料采用t 检验或单因素方差分析，用LSD 法对需要比较的组间均值进行两两比较。数据以均数±标准差(±s)表示，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 姜黄素吸收光谱

姜黄素吸收波长在360 ～480 nm 范围内，提示姜黄素在此波长范围中有明显的PDT 作用。

2 光敏化姜黄素对人胃腺癌MGC－803 细胞增殖的影响

单纯光照对MGC－803 细胞增殖没有明显抑制作用，单纯5μmol/L 姜黄素对MGC－803 细胞增殖则显示明显抑制作用，细胞抑制率为(29.74 ±2.30)%;光敏化则可以进一步增强姜黄素对MGC－803 细胞增殖的抑制作用，细胞抑制率为(44.93 ±3.61)%。单纯姜黄素组与空白组比较，差异有统计学意义(P ＜0.01);姜黄素PDT 组与单纯姜黄素组比较，差异有统计学意义(P ＜0.01)，见表1。

3 光敏化促进姜黄素诱导人胃腺癌MGC－803 细胞凋亡

由图1 和表2 可知，单纯光照对MGC－803 细胞生长及其凋亡没有明显作用;单纯5 μmol/L 姜黄素能够影响MGC－803 细胞的周期分布，诱导MGC－803 细胞凋亡:G0/G1期细胞明显增多，G2/M 期细胞下降，并且出现明显亚G1二倍体峰，其细胞凋亡率为(12.54 ±1.75)%;光敏化则可以进一步增强姜黄素诱导MGC－803 细胞凋亡，其细胞凋亡率为(26.58 ±2.67)%。单纯姜黄素组与空白组比较，差异有统计学意义(P ＜0.01);姜黄素PDT 组与单纯姜黄素组比较，差异有统计学意义(P ＜0.01)。

表1 光敏化姜黄素对人胃腺癌MGC－803 细胞增殖的影响Table 1. Effects of photoactivated curcumin on proliferation of human gastric cancer MGC－803 cells (%. ±s.n =10)

＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs curcumin group.PDT:photodynamic therapy.

Croup Inhibitory rate Control 2.85 ±0.87 Pure light 3.38 ±0.94 Curcumin 29.74 ±2.30＊＊Curcumin+PDT 44.93 ±3.61△△

Figure 1. Photoactivation promoted curcumin to induce the apoptosis of human gastric cancer MGC－803 cells(flow cytometry).A:control group;B:pure light group;C:curcumin group;D:curcumin+PDT (photodynamic therapy)group.图1 光敏化促进姜黄素诱导人胃癌MGC－803 细胞凋亡

表2 光敏化姜黄素对人胃腺癌MGC－803 细胞细胞周期和凋亡的影响Table 2. Effects of photoactivated curcumin on cell cycle and apoptosis of human gastric cancer MGC－803 cells(%. ±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs curcumin group.

Group G0/G1 S G2/M Apoptotic rate Control 39.65±4.97 26.92±3.74 33.43±3.95 3.34±0.55 Pure light 38.74±4.95 25.54±3.60 35.72±3.86 2.85±0.48 Curcumin 58.53±5.23 21.41±3.17 20.06±3.84 12.54±1.75＊＊Curcumin+PDT 64.70±5.67 19.71±3.20 15.59±3.02 26.58±2.67△△

Hoechst 33258 染色显示，空白组、单纯光照组基本没有明显的形态学变化，姜黄素作用48 h 后，在光学显微镜下可见部分人胃腺癌MGC－803 细胞胞体收缩、核浓缩，呈现特异性紫蓝色，即判断为凋亡细胞。姜黄素PDT 组可见明显的细胞核形态改变，表现为染色质凝集，并有染色质的凋亡小体形成，此外也可见到核边缘模糊，核区形态不规则，荧光微弱且不均匀的坏死细胞，见图2。

4 姜黄素及其光敏化对MGC－803 细胞线粒体膜电位、活性氧和细胞内Ca2+的影响

单纯姜黄素作用于MGC－803 细胞，线粒体膜电位在6 h 时已显著下降，24 h 时下降至最低;细胞内活性氧在6 h 时也显著升高，24 h 时仍然维持高水平;细胞内Ca2+在6 h 时显著升高，24 h 时下降至接近对照组水平。光敏化姜黄素作用MGC－803 细胞，则可进一步影响线粒体膜电位、活性氧和细胞内Ca2+的变化，与单纯姜黄素作用比较，差异有统计学意义(P ＜0.01)，见表3。

Figure 2. Effects of photoactivated curcumin on MGC－803 cell nuclear morphology (Hoechst 33258 staining， ×200).A :control group;B:pure light group;C:curcumin group;D:curcumin+PDT group.图2 光敏化和姜黄素对MGC－803 细胞核形态的影响

表3 光敏化姜黄素与单纯姜黄素对MGC－803 细胞线粒体膜电位、活性氧和细胞内Ca2+的影响Table 3. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on mitochondria membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+ in MGC－803 cells (%. ±s.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs curcumin group.

Group 2+MMP ROS Ca 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Photoactivated curcumin 79.5±5.5＊＊ 70.8±5.5＊＊ 66.2±5.5＊＊ 134.9±5.8＊＊ 120.4±5.8＊＊ 115.7±5.8＊＊ 127.6±5.6＊＊ 105.3±5.6＊＊ 104.6±5.6＊＊Curcumin 90.9±5.5 80.7±5.5 81.6±5.5 109.7±5.8 106.4±5.8 103.2±5.8 109.9±5.6 102.1±5.6 1 01.8±5.6

5 姜黄素及其光敏化对MGC－803 细胞caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的影响

单纯姜黄素作用于MGC－803 细胞，凋亡蛋白caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性增加;而光敏化姜黄素作用MGC－803 细胞，则可进一步增加caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的变化，与单纯姜黄素比较，差异显著(P ＜0.01)，见表4。

表4 光敏化姜黄素与单纯姜黄素对MGC－803 细胞caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的影响Table 4. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on the activity of caspase－3，caspase－8 and caspase－9 in MGC－803 cells(%. ±s.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs curcumin group.

Caspase－3 Caspase－8 Caspase－9 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Curcumin 107.2±5.3 111.5±5.3 115.9±5.3 115.3±5.7 117.2±5.7 119.4±5.7 112.4±5.3 114.8±5 Group.3 118.7±5.3 Photoactivated curcumin 116.8±5.3＊＊ 126.7±5.3＊＊ 128.5±5.3＊＊ 127.4±5.7＊＊ 126.5±5.7＊＊ 125.4±5.7 ＊＊ 122.7±5.3＊＊ 126.5±5.3＊＊ 125.8±5.3＊＊

6 姜黄素及其光敏化对MGC－803 细胞Bcl－2、细胞色素C、Bax 和HSP70 蛋白水平影响

单纯姜黄素作用MGC－803 细胞，可使Bcl－2 和HSP70 蛋白表达水平下调，增加胞浆细胞色素C，对Bax 蛋白水平影响不明显;而光敏化姜黄素作用于MGC－803 细胞，则可使Bcl－ 2 和HSP70 蛋白表达水平进一步下降，而且胞浆细胞色素C 上升更高，与单纯姜黄素作用比较，差异有统计学意义(P ＜0.01)，见图3。

Figure 3. Effects of photoactivated curcumin and curcumin on levels of cytochrome C，Bcl－2，Bax and HSP70 in MGC－803 cells. Con:control;Cur:curcumin;P－Cur:photoactivated curcumin. ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs Con;△△P ＜0.01 vs Cur.图3 光敏化姜黄素与单纯姜黄素对MGC－803 细胞中cytochrome C、Bcl－ 2、Bax 和HSP70 水平的影响

讨论

PDT 是近年来兴起的利用选择性蓄积于肿瘤组织的光敏剂在适当波长激光下发生光敏反应定位杀伤组织细胞的新型肿瘤治疗方法［3］。随着光纤技术、激光医学和内镜技术发展而兴起的一种治疗恶性肿瘤的新方法，专家预测在2l 世纪光动力治疗将成为一种重要医疗手段。然而现在常用的光敏剂多为卟啉及其衍生物的混合制品、成分复杂、化学结构不稳定、易受生物代谢因素的影响，其光敏损伤作用的程度不易控制，影响疗效的稳定性。近年来国内外的研究发现姜黄素是高效、低毒的新型理想光敏剂［4］。

姜黄素本身具有抗肿瘤、抗炎等多种药理作用。其作为光敏剂在激光照射后能吸收能量，产生有细胞毒作用的单线态氧和其它氧自由基等活性氧，这些物质和细胞内成分发生光化学反应，诱导细胞凋亡、造成细胞损伤甚至死亡。本研究表明姜黄素在360 ～480 nm 范围内的激光照射具有明显的PDT 作用。光敏化作用显著促进姜黄素抑制胃癌MGC－803 细胞的增殖，促进细胞凋亡。从而证实了姜黄素对胃腺癌MGC－803 细胞具有光毒效应。本研究还发现细胞周期主要阻滞于G0/G1期。有研究表明在日光灯照条件下姜黄素诱导MGC－803 细胞凋亡主要阻滞于G2/M 期［3］，析其原因，可能是与光照条件不一致有关。还有研究表明姜黄素能诱导人胃腺癌BGC－823 细胞、Hep－2 细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G0/G1期［5－6］。这说明姜黄素诱导不同的肿瘤细胞，其细胞阻滞的周期有差异。

细胞凋亡是细胞主动参与的自主性死亡过程，可被多种药物及理化因素诱发。有研究表明姜黄素能诱导HL－60 细胞凋亡、肺癌NCI－H460 细胞凋亡［7－8］。细胞凋亡程序是一个复杂的、涉及多基因的过程，主要有线粒体和细胞表面受体介导这2 条途径。有研究表明南海真菌代谢产物1386A 可能通过线粒体途径诱导MGC－803 细胞凋亡［9］。bcl－2基因家族是研究最为深入的凋亡调控基因之一，根据其不同的生物学效应，主要分为以Bax、Bcl－2 和Bid 为代表的3 类蛋白，其中促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl－2 在细胞凋亡的调控过程中发挥着重要作用［10－11］。细胞是否发生凋亡及凋亡的严重程度取决于Bcl－2/Bax 的比值［12］。Bcl－2 家族、线粒体细胞色素C 及caspase 是细胞内凋亡信号通路的基本成分［13］。当Bcl－2/Bax 比值降低时，可导致线粒体细胞色素C 的释放，同时激活凋亡蛋白caspase。Caspase 被认为是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白，一旦活化发生级联反应，凋亡即进入不可逆的阶段。而caspase－3 在caspase 家族14 个成员中是最重要的效应型。有研究表明姜黄素通过激活白血病HL60 细胞线粒体途径的caspase－3 等的降解诱导凋亡［14］。也能够通过caspase－3 等机制诱导肺癌NCI－H460 细胞凋亡［8］。

有研究表明perifosine 诱导胃癌细胞SGC－7901凋亡与caspase 家族和Bcl－2 家族蛋白的表达密切相关［15］。我们通过Western blotting 分析，姜黄素作用于MGC－803 细胞之后，其抗凋亡蛋白Bcl－2 的表达下调，而促凋亡蛋白Bax 的表达明显增加，Bcl－2/Bax 比值显著降低。同时HSP70 蛋白表达水平下降，细胞色素C 明显增加。HSP70 能抑制Bcl－2 的表达，起到促凋亡的作用。Bcl－2 抑制线粒体释放细胞色素C，当Bcl－2 水平下降时，细胞色素C 增加，激活凋亡蛋白caspase，促进凋亡。本实验发现凋亡蛋白caspase－3、caspase－8 和caspase－9 的活性明显增高，线粒体膜电位、活性氧和细胞内Ca2+及流式细胞分析仪的结果均显示细胞凋亡明显增加，可推测姜黄素通过下调Bcl－2，上调Bax 的表达，激活了caspase－3、caspase－8 和caspase－9 的活性，使其触发了凋亡程序，导致MGC－803 细胞凋亡。这对于姜黄素的临床应用具有重要意义。

综上所述，光敏化姜黄素主要通过Bcl－2 和线粒体途径增强其诱导胃癌MGC－803 细胞凋亡作用，其它的凋亡机制还有待进一步研究。

(致谢:承蒙华南师范大学生命激光研究所魏华江教授以及广东药学院心血管病研究所亓翠玲教授等的热心指导和帮助，在此致以衷心的感谢。)

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