siRNA－survivin 与GRIM－19 共表达质粒的构建及其对前列腺癌DU145 细胞生长的抑制作用*

沈维高， 赵丽晶， 盖晓东， 芦丽莉， 葛 贺， 陈立松， 刘艳波△， 赵雪俭△

(1北华大学基础医学院病理生理学教研室，吉林 吉林132013;2吉林大学前列腺疾病防治研究中心，吉林 长春130021)

存活蛋白(survivin)属于凋亡抑制蛋白，其表达强弱与前列腺癌的发生、发展、转移及预后密切相关，可作为前列腺癌预后的分子标志物［1－2］。利用RNA 干扰技术抑制细胞内survivin 的过度表达可抑制肿瘤的生长，从而起到抗肿瘤作用［3］。GRIMs(genes associated with retinoid－interferon－induced mortality)属于维甲酸(retinoic acid，RA)－ 干扰素(interferon，IFN)诱导 死亡 的相 关 基 因 家 族［4］。GRIM－19 是GRIMs 家族重要成员，在正常细胞内高表达，而在癌细胞内表达降低或缺失，而其高表达能抑制肿瘤细胞的增殖，并促进其凋亡［5－6］。RNA干扰并不能100%抑制目的基因的表达，于是我们尝试沉默survivin 同时高表达GRIM－19，而有关其对肿瘤的生长抑制作用国内外未见报导。本研究拟构建siRNA－survivin 和GRIM－19 共表达质粒，在降低细胞癌基因同时增强死亡调节因子的表达，从而增强抗肿瘤效应，为前列腺癌的基因治疗提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

人前列腺癌DU145 细胞株由吉林大学前列腺防治研究中心馈赠。细胞用含有10% 胎牛血清的DMEM 培养液37 ℃、5% CO2的孵箱内培养，以0.25%的胰酶消化传代。

2 主要试剂

T4 DNA 连接酶购自Promega;Bgl Ⅱ、Nru Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA 凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程公司;DNA purification system 为Promega产品;DNA DL2000 marker 和DL15000 marker 均为TaKaRa 产品。引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务公司完成。溴化乙啶、琼脂糖、MTT 和DMSO 购自Sigma;DEPC 购自Merk;高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、MMV 逆转录酶及质粒提取和纯化试剂盒购自Promega;RNA 酶及蛋白酶K 购于Ambion;Lipofectamine 2000 及Trizol 为Invitrogen 产品;胰酶、DMEM 培养基和胎牛血清为Hyclone 产品;其它常规化学试剂均为国产分析纯产品。

3 主要方法

3.1 真核表达质粒siRNA－survivin 和GRIM－19的构建 在本课题组前期工作的基础上，扩增已构建成功的pGCsilencer－U6－siRNA－survivin 质粒(简称pGCsi－sur)的U6 启动子及siRNA－survivin［7］，在其上、下游分别引入BglⅡ和NruⅠ双酶切位点，与线性化的TA 载体连接，然后进行扩增，其上游引物为5'－GC (AGATCT)TGCTTCGCGATGTACGGGCC－ 3';下游引物为5'－CG(TCGCGA)GGGCTATGAACTAATGACCC－3';PCR 扩增条件:94℃5 min，94 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，72 ℃45 s，35 个循环;扩增片段长度为585 bp。PCR 产物电泳、回收、连接后测序。用限制性内切酶BglⅡ和NruⅠ双酶切pcDNA3.1－GRIM－19 质粒(由美国胡嘉娣老师馈赠)，使其线性化，回收，将U6－siRNA－survivin 与线性化的pcDNA3.1－GRIM－19(简称pGRIM－19)连接，插入pcDNA3.1－GRIM－19 多克隆酶切位点内，共表达基因质粒构建成功，命名为pcDNA3.1－GRIM－19/siRNA－survivin (简 称pGRIM－19－si－survivin)，将重组质粒转化到大肠杆菌，挑取单克隆后扩增，提取质粒并测序鉴定。共表达质粒的构建过程如图1 所示。

3.2 细胞转染 应用脂质体Lipofectamine 2000 将重组质粒psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 分别转染人前列腺癌细胞DU145 中，48 h 后提取RNA，检测survivin 和GRIM－19 mRNA 表达水平。

Figure 1. The construction process of pGRIM－19－si－survivin co－expression plasmid图1 表达质粒pGRIM－19－si－survivin 的构建

3.3 Survivin 和GRIM－19 mRNA 表达的检测 应用Trizol 试剂提取转染后各组细胞的总RNA，然后逆转录生成cDNA，应用人β－actin 引物进行扩增，鉴定模板质量。β－actin 的引物序列为:sense:5'－CTGGGACGACATGGAAAA－3'，antisense:5'－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC－3'，扩增片段长度为600 bp;survivin 引物序列:sense:5'－GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC－3'，antisense:5'－AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC－3'，扩增片段长度为415 bp;GRIM－19 引物序列:sense:5'－CTGGGACGACATGGAGA-AA－3'，antisense:5'－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC－3'，扩增片段长度为485 bp。所有引物均由上海生工生物技术有限公司合成。PCR 产物琼脂糖凝胶电泳后拍照，并进行定量分析。

3.4 细胞增殖活性检测 将实验分为5 组，即mock、psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin，每组设5 个复孔。取对数生长期细胞进行转染，在培养细胞44 h 和68 h 后，各孔加入浓度为5 g/L MTT，常规方法检测各孔的吸光度(absorbance，A)，按公式:抑制率(%)= (对照组A 值－实验组A 值)/对照组A 值×100%，计算各组抑制率。

4 统计学处理

采用SPSS 12.0 统计学软件进行分析，数据以均数±标准差(± s)表示，组间比较采用One－way ANOVA，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 pGRIM－19－si－survivin 共表达质粒的鉴定

根据前期的研究结果，以pGCsi－sur 为模板扩增U6－siRNA－survivin 片段，见图2，然后与TA 载体连接，用BglⅡ和NruⅠ双酶切，获得约585 bp 长度的片段，见图3，测序结果与设计完全吻合，U6－siRNA－survivin 测序结果见图4。

用BglⅡ和NruⅠ双酶切pGRIM 和pGRIM－19－si－survivin，其电泳图见图5、6，证明共表达质粒构建成功。

Figure 2. Electrophoretic identification of specific U6－siRNAsurvivin PCR product. M:DL2000 DNA marker.图2 U6－siRNA－survivin PCR 产物的电泳鉴定结果

Figure 3. Electrophoretic identification of pMD18－U6－survivin plasmid digested with BglⅡand NruⅠ. M:DL15000 DNA marker;Lane 1，3:pMD18－U6－survivin recombinant plasmid;Lane 2，4:pMD18－U6－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.图3 pMD18－U6－survivin 质粒的双酶切鉴定结果

2 共表达质粒对DU145 细胞survivin 和GRIM－19 mRNA 表达影响

与mock 组比较，psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 组及pGRIM－19－si－survivin 组survivin mRNA 表达水平分别为1.02 ± 0.09、0.55 ±0.05、0.62 ± 0.08 和0.35 ± 0.05，mock 与psi－scramble 无显著差别(P ＞0.05)，而psi－survivin 和pGRIM－19 组survivin 的表达水平降低，共表达组降低更明显(P ＜0.05，P ＜0.01)。psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 组GRIM－19 表达增强，分别为mock 组的1.93 ±0.14、2.57 ±0.20 和4.12 ±0.21(P ＜0.01)，而psi－scramble 的表达水平为0.94 ±0.14，未有明显变化(P ＞0.05);与pGRIM－19 组比较，pGRIM－19－si－survivin 增强pGRIM－19 表达的作用更明显(P ＜0.05)，显示出协同作用，见图7。

Figure 4. The nucleotide base sequence of U6－siRNA－survivin.图4 U6－siRNA－survivin 的测序结果

3 共表达质粒对DU145 细胞增殖抑制作用

DU145 转染重组质粒后培养48 h 及72 h，应用MTT 比色法观察各组细胞的增殖能力，以mock 组的生存率为100%，转染48 h 后，psi－scramble 组的生存率为94.0% ± 7.3%，两者之间无差异(P ＞0.05);而psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 3 组细胞生存率分别为58.0% ±7.2%、62.1% ±6.1%和50.2% ±4.8%，与mock 组比较差异显著(P ＜0.05)，pGRIM－19－si－survivin 组与psi－survivin 和pGRIM－19 组比较差异不明显(P ＞0.05);转染72 h 后psi－scramble 组的增殖率为90.1% ±5.5%，psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 3 组分别为43.4% ± 4.3%、51.3% ±6.7%和26.8% ±7.1%，与两阴性对照组相比，差异明显(P ＜0.05，P ＜0.01);与psi－survivin 和pGRIM－19 组比较，pGRIM－19－si－survivin 抑制作用明显增强(P ＜0.05)，显示出协同抑制效应，见图8。

Figure 5. Electrophoretic identification of pGRIM－19 plasmid digested with BglⅡand NruⅠ. M1:DL15000 DNA marker;Lane 1:pGRIM－19 recombinant plasmid;Lane 2:pGRIM－19 recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.图5 pGRIM－19 双酶切鉴定结果

Figure 6. Electrophoretic identification of pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ.M1:DL15000 DNA marker;Lane 1:pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid;Lane 2:pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.图6 pGRIM－19－si－survivin 重组质粒双酶切鉴定结果

讨 论

凋亡抑制蛋白survivin 可特异性表达在人和鼠的胚胎发育组织，也可表达于人类多种肿瘤组织，在成人的正常组织中几乎不表达［8］。我们前期研究表明survivin 在前列腺癌组织高表达，其异常激活导致细胞凋亡减少，进而参与了前列腺癌的发生和发展［9］。而且，针对survivin 的小干扰RNA，体内外均可下调前列腺癌survivin 基因表达并具有抑瘤效应［10］。但在哺乳动物细胞中，RNAi 并不能完全阻断基因表达，尤其是异常高表达的基因。RNAi 只能降解与其序列同源的mRNA，对已经表达的蛋白，应用RNAi 方式是无法清除的。为了提高抗肿瘤作用，我们选择联合基因治疗手段，即沉默survivin 同时增加另一种抗肿瘤基因(GRIM－19)的表达。

Figure 7. RT－PCR analysis of survivin and GRIM－19 mRNA expression in DU145 cells transfected with recombinant plasmids. ±s. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock or psi－scramble;#P ＜0.05 vs psi－survivin or pGRIM－19.图7 pGRIM－19－si－survivin 重组质粒转染DU145 细胞后survivin 和GRIM－19 基因表达情况

Figure 8. Growth inhibition of DU145 cells transfected with different plasmids. ± s. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock or psi－scramble;#P ＜0.05 vs psi－survivin or pGRIM－19.图8 pGRIM－19－si－survivin 重组 质粒对前列腺癌DU145 细胞增殖抑制作用

GRIM－19 是由IFN－β 联合RA 诱导表达的死亡调节因子，在大多数正常组织中高表达，但在多数肿瘤组织表达降低或缺失。刘艳波等［10］研究发现:前列腺癌组织及前列腺癌细胞GRIM－19 表达为阴性，这种差异性使得GRIM－19 作为靶基因进行治疗成为可能。GRIM－19 高表达后可明显抑制STAT3 的表达，而抑制STAT3 的信号转导，可影响其对survivin 的表达调控，进而抑制肿瘤细胞的增殖过程［11］。根据前期工作，在增强GRIM－19 表达的同时抑制survivin 表达，有望成为肿瘤基因治疗的新策略。本研究应用基因重组技术成功构建了真核共表达质粒pGRIM－19－si－survivin，应用RT－PCR 技术检测发现:该质粒在下调survivin 表达同时增强了GRIM－19 的表达。应用MTT 法检测了其对细胞增殖作用的影响，发现该质粒可协同性地抑制前列腺癌DU145 细胞的增殖，并呈现时间依赖关系。上述结果为研究该质粒的作用机制奠定了基础，为前列腺癌的基因治疗指明了方向。

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