血管紧张素Ⅱ升高血管内皮细胞中ROS 水平并激活自噬通路*

范 俊， 杨成明△， 连继勤， 曾春雨， 倪振洪， 林德胜， 冉 希

(1第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科，重庆400042;2第三军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，重庆400038)

在高血压、心肌梗死等心血管疾病的发生过程 中，血液中血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)的浓度显著升高［1］。在高浓度AngⅡ的刺激下，血管内皮细胞(vascular endothelial cell)中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生增加，造成细胞中氧化蛋白和受损线粒体的大量积累，从而导致细胞自身损伤，严重影响了血管内皮细胞的屏障功能以及保持血管内膜光滑、调节血管舒张和收缩、抑制血栓形成等功能，与心血管疾病的发生密切相关［2－4］。

随着近年对细胞自噬(autophagy)研究的深入，发现自噬可以通过细胞溶酶体系统降解有毒物质以及受损的蛋白质、细胞器，并在营养不足、缺氧等情况下循环利用降解上述物质释放出的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等小分子物质及能量以维持细胞的稳态［5－7］。由此推测，在由AngⅡ引发损伤的血管内皮细胞中，自噬可能是防止细胞损伤的一种潜在机制，有可能成为心血管疾病治疗的新靶点和新策略［6－7］。目前关于AngⅡ与血管内皮细胞自噬之间关系的研究尚不多见。本研究中，我们观察了AngⅡ对血管内皮细胞自噬的影响，并初步探讨了AngⅡ诱导细胞自噬的可能机制。我们发现AngⅡ能够增强血管内皮细胞中ROS 的产生，而且AngⅡ促进自噬的作用可被抗氧化剂所抑制。因此，AngⅡ可能通过升高血管内皮细胞中ROS 水平促进自噬发生。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人脐静脉细胞融合细胞EA.hy926，由第三军医大学基础部生物化学教研室保存并赠送。胎牛血清和DMEM 购于Gibco;AngⅡ、N－乙酰半胱氨酸(Nacetyl－L－cysteine，NAC)、吖啶橙(acridine orange，AO)和3－甲基腺嘌呤(3－methyladenine，3－MA)购自Sigma;活性氧检测试剂盒购自中国江苏碧云天公司;微管相关蛋白轻链3－Ⅱ(microtubule－associated protein light chain，3－Ⅱ，LC3－Ⅱ)抗体购自Cell signaling;Ⅱ抗购自Santa Cruz。

2 方法

2.1 细胞培养 人脐静脉细胞融合细胞EA.hy926于含10%小牛血清的DMEM 培养基，37 ℃、5% CO2条件下培养。2 ～3 d 换1 次液，待细胞融合至约80%时，0.25%胰酶消化传代，2 ～3 代EA 细胞用于实验。

2.2 活性氧检测 取对数生长期的EA. hy926 细胞，以1 ×107/L 的密度接种96 孔板中，待细胞贴壁后将细胞分为正常对照组、Ang Ⅱ(10－7mol/L)、NAC(50 μmol/L)和AngⅡ(10－7mol/L)+NAC(50 μmol/L)，处理24 h 后按照1∶1 000 用无血清培养液稀释DCFH－DA，使终浓度为10 μmol/L，在37 ℃细胞培养箱内孵育20 min 后，用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，使用荧光酶标仪(488 nm 激发波长，525 nm 发射波长)检测荧光的强弱。

2.3 吖啶橙染色(acridine orange，AO) 将DMEM(含10 %胎牛血清)培养的EA. hy926 细胞以5 ×107/L 的密度接种12 孔板中，待细胞贴壁后将细胞分为正常对照组、Ang Ⅱ(10－7mol/L)、Ang Ⅱ(10－7mol/L)+3－MA(2 mmol/L)和AngⅡ(10－7mol/L)+NAC(50 μmol/L)组，细胞于终止培养24 h 前20 min，加入吖啶橙染液，终浓度100 μmol/L，避光培养20 min后，用PBS 冲洗2 遍，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.4 蛋白免疫印迹实验(Western blotting) 取对数生长期的EA. hy926 细胞，以5 ×108/L 的密度接种于6 孔板中，待细胞贴壁后加入相应处理因素，处理24 h 后用RIPA 裂解液提取细胞蛋白，BCA 法测蛋白浓度，SDS－PAGE 电泳每孔上样50 μg 的蛋白后经转膜、封闭，LC3－Ⅱ抗体(1∶1 000)和羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)孵育后，显色曝光。

3 统计学处理

结 果

1 EA.hy926 细胞内ROS 水平的检测

AngⅡ(10－7mol/L)组较对照组ROS 荧光值显著升高，差异有统计学意义(P ＜0. 05);而Ang Ⅱ(10－7mol/L)+ NAC(50 μmol/L)组较AngⅡ(10－7mol/L)组显著降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图1。

Figure 1. The influence of AngⅡ(10 －7 mol/L)combined NAC(50 μmol/L)on ROS level in EA.hy926 cells. ±s.n =6. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs AngⅡgroup.图1 AngⅡ对EA.hy926 细胞ROS 水平的影响

2 AngⅡ促进EA.hy926 细胞发生自噬

2.1 不同浓度AngⅡ对EA.hy926 细胞发生自噬的影响 与对照组相比较，不同浓度Ang Ⅱ对EA.hy926 细胞LC3－Ⅱ蛋白表达有促进作用(P ＜0.05)，且与作用浓度有关，在10－8mol/L 和10－7mol/L 组中，LC3－Ⅱ蛋白表达量明显高于10－6mol/L 组(P ＜0. 05)，因此，我们在后续实验中均采用10－7mol/L 作为AngⅡ的使用剂量，见图2。

Figure 2. LC3－Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA.hy926 cells after stimulated by different concentrations of AngⅡ. ±s.n=6. * P ＜0.05 vs 0 mol/L;△P＜0.05 vs 10 －6 mol/L.图2 Western blotting 检测不同浓度AngⅡ处理后EA.hy926 细胞LC3－Ⅱ蛋白的表达

2.2 AngⅡ不同作用时间对EA.hy926 细胞发生自噬的影响 以浓度为10－7mol/L 的AngⅡ分别刺激EA.hy926 细胞0 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 后，收集细胞，用Western blotting 检测LC3－Ⅱ蛋白表达。结果显示，6 h、12 h、24 h 和36 h 组的LC3－Ⅱ蛋白表达均较0 h 组明显增强(P ＜0.05)，24 h 组LC3－Ⅱ蛋白表达比6 h、12 h 和36 h 组均明显增强(P ＜0.05)，见图3。AngⅡ对EA.hy926 细胞中LC3－Ⅱ蛋白表达的促进作用随着时间延长逐渐增强，24 h后达到最大。

Figure 3. LC3－Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA.hy926 cells after stimulated by Ang Ⅱ(10 －7mol/L)for different time. ± s. n =6. * P ＜0.05 vs 0 h;△P ＜0.05 vs 6 h，12 h or 36 h.图3 Western blotting 检测AngⅡ作用不同时间后EA.hy926 细胞LC3－Ⅱ蛋白的表达

2.3 AO 染色观察AngⅡ对EA. hy926 细胞自噬的影响 经AO 染色后在荧光显微镜下观察EA.hy926 细胞自噬的变化，胞质内呈酸性的自噬体囊泡结构被染成明亮的橘红色，而其它细胞部位呈绿色。AngⅡ(10－7mol/L)组胞质内橘红色自噬体结构较对照组明显增多，见图4。

Figure 4. Evaluation of autophagy in EA.hy926 cells by fluorescence microscopy after stained with acridine orange (×200).A:control group;B:AngⅡ(10 －7 mol/L)group.图4 AO 染色后荧光显微镜下观察EA.hy926 细胞自噬

3 AngⅡ引起的EA. hy926 细胞自噬可以被3－MA 所抑制

Rapamycin(阳性对照)和AngⅡ对EA.hy926 细胞LC3－Ⅱ蛋白表达有促进作用(P ＜0.05)，而3－MA 对AngⅡ诱导的LC3－Ⅱ蛋白表达有抑制作用(P ＜0.05)，见图5。

4 AngⅡ引起的EA. hy926 细胞自噬可以被NAC所抑制

4.1 Western blotting 检测EA.hy926 细胞自噬的变化

H2O2组的LC3－Ⅱ蛋白表达均较对照组明显增强(P ＜0.05)，而NAC+H2O2组较H2O2组LC3－Ⅱ蛋白表达有明显减弱(P ＜0.05)，见图6A;H2O2(作为阳性对照)组和AngⅡ组的LC3－Ⅱ蛋白表达均较对照组明显增强(P ＜0.05)，NAC 组较对照组LC3－Ⅱ蛋白无明显差异(P ＞0.05)，而NAC+AngⅡ组较AngⅡ组LC3－Ⅱ蛋白表达有明显减弱(P ＜0.05)，见图6B。

4.2 AO 染色观察EA.hy926 细胞自噬的变化 AngⅡ处理组胞质内橘红色自噬小体较对照组明显增多，而AngⅡ+3－MA 组和AngⅡ+NAC 组胞质内橘红色自噬小体较AngⅡ(10－7mol/L)组明显减少，见图7。

Figure 5. LC3－Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA. hy926 cells after treated with Ang Ⅱ(10 －7 mol/L)，3－MA(2 mmol/L)and rapamycin(Rap，1 mg/L，positive control for autophagy). ± s. n = 6.* P ＜0.05 vs control group;△P ＜0. 05 vs Ang Ⅱgroup.图5 Western blotting 检测AngⅡ联合3－MA 处理后EA细胞LC3－Ⅱ蛋白的表达

Figure 6. Expression of LC3－Ⅱprotein in different groups detected by Western blotting.A:LC3－Ⅱprotein level in EA.hy926 cells after treated with H2O2(200 μmol/L)and/or NAC(50 μmol/L). ± s. n =6. * P ＜0.05 vs control and H2O2 + NAC group.B:LC3－Ⅱprotein level in EA.hy926 cells after treated with AngⅡ(10 －7 mol/L)and/or NAC(50 μmol/L).H2O2(200 μmol/L)served as a positive control for autophagy. ±s. n =6. #P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs AngⅡgroup.图6 Western blotting 检测各组EA.hy926 细胞LC3－Ⅱ蛋白的表达

Figure 7. Evaluation of autophagy in EA.hy926 cells by fluorescence microscopy after stained with acridine orange (×200).A:control group;B:AngⅡ(10 －7 mol/L)group;C:AngⅡ+3－MA(2 mmol/L)group;D:AngⅡ+NAC(50 μmol/L)group.图7 AO 染色后荧光显微镜观察EA.hy926 细胞自噬

讨 论

血管内皮细胞在维持正常的血管功能和结构中具有关键性作用，内皮功能损伤是多种心血管疾病的关键环节［8］。AngⅡ作为引起氧化应激最强烈的刺激物之一，在心血管疾病发生过程中明显升高。AngⅡ在多种酶如黄嘌呤氧化酶、细胞色素P450、一氧化氮合酶、NADPH 氧化酶等参与下，主要通过其I型受体介导血管内皮细胞产生过多的ROS，从而导致了内皮功能损伤［2，4，9］。因此，ROS 水平升高是AngⅡ引起内皮功能损伤的主要原因。本研究发现高于生理浓度(10－7mol/L)的AngⅡ作用于EA 细胞24h 后，与对照组相比，细胞内ROS 水平均明显升高(均P ＜0.05);而NAC 组和AngⅡ+NAC 组，与AngⅡ组相比，细胞内ROS 水平明显降低(均P ＜0.05)。这些结果再次证实了AngⅡ能够引起血管内皮细胞内ROS 的产生增加。

自噬作为真核细胞通过溶酶体系统降解自身成分的一个高度保守的代谢过程，其对于清除聚集的氧化蛋白和受损的细胞器以及维持细胞的稳态具有非常重要的作用［10］。因此，自噬是保护血管内皮细胞免受ROS 损伤的重要机制。在自噬过程中LC3蛋白发挥了重要作用，以LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ2 种形式存在，其中LC3－Ⅰ为非活化形式，主要存在于胞质中;LC3－Ⅰ在自噬发生时与磷脂酰乙醇胺结合转变为LC3－Ⅱ并结合于自噬体膜上，对自噬体的延伸及最终的闭合起着重要作用，且LC3－Ⅱ一直定位在自噬体膜上直至被溶酶体酶降解，是目前反映细胞内自噬水平的特异性蛋白标记物［11－13］。为了研究AngⅡ对血管内皮细胞自噬的影响，本实验选择3 个高于正常生理浓度的Ang Ⅱ干预体外培养的EA.hy926 细胞，同时以浓度为10－7mol/L 的AngⅡ分别刺激EA. hy926 细胞不同时间后，通过Western blotting 检测LC3－Ⅱ蛋白的表达变化，并通过AO染色观察自噬体的形成。我们发现AngⅡ对EA 细胞LC3－Ⅱ蛋白表达有促进作用，并且能够促进自噬体的形成，这些结果均证明了AngⅡ能够诱导血管内皮细胞发生自噬。实验还发现，与10－6mol/L 作用相比，10－8与10－7mol/L 的AngⅡ对EA 细胞的自噬诱导作用更强烈，表明EA 细胞自噬水平的强弱与AngⅡ浓度的高低并不完全成正比关系，相关机制尚需进一步研究探讨。

3－MA 是细胞内I 型与Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶的特殊性抑制剂，这两种酶的活性尤其是Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶的活性与细胞自噬的发生密切相关，因此，3－MA 通常作为细胞自噬的特异性抑制剂［14－15］。本实验结果提示，3－MA 联合AngⅡ作用于EA.hy926 细胞后能够明显抑制AngⅡ诱导的细胞自噬，并且AO 染色也发现AngⅡ联合3－MA 作用EA.hy926 细胞后，胞质内自噬体(橘红色点状结构)较AngⅡ组明显减少，自噬水平显著降低，说明AngⅡ诱导的EA 细胞自噬依赖于Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶的激活。

多项研究表明，氧化应激是诱导细胞自噬发生的重要原因［13，16－17］。为了确定AngⅡ诱导的氧化应激与细胞自噬之间是否存在因果关系，本实验选择特异性抗氧化剂NAC［18］联合H2O2或AngⅡ作用于EA.hy926 细胞后检测其自噬水平。结果表明，NAC可以明显抑制H2O2或AngⅡ诱导细胞自噬水平，并且AO 染色也发现AngⅡ联合NAC 作用EA. hy926细胞后，胞质内自噬体(橘红色点状结构)较AngⅡ组明显减少，说明ROS 水平升高可能是AngⅡ诱导EA.hy926 细胞发生自噬的主要原因。

目前，自噬与心血管疾病关系的研究已成为一个新的热点，虽然还存在很多未知因素，但对AngⅡ、ROS 和自噬三者间关系了解的不断深入，将有助于研究者根据不同心血管疾病发生过程中细胞自噬水平的特点和变化，发现新的治疗靶点和防治策略。

［1］ De Mello WC，Danser AH. AngiotensinⅡand the heart:on the intracrine renin－angiotensin system［J］. Hypertension，2000，35(6):1183－1188.

［2］ Landmesser U，Spiekermann S，Preuss C，et al. AngiotensinⅡinduces endothelial xanthine oxidase activation:role for endothelial dysfunction in patients with coronary disease［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(4):943－948.

［3］ Cai H，Harrison DG. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases:the role of oxidant stress［J］. Circ Res，2000，87(10):840－844.

［4］ 尤寿江，石际俊，张艳林. ROS 介导的自噬及其在相关疾病中的作用［J］. 中国病理生理杂志，2011，27(1):187－190，195.

［5］ Baehrecke EH. Autophagy:dual roles in life and death?［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(6):505－510.

［6］ Nishida K，Kyoi S，Yamaguchi O，et al. The role of autophagy in the heart［J］. Cell Death Differ，2009，16(1):31－38.

［7］ De Meyer GR，Martinet W. Autophagy in the cardiovascular system［J］. Biochim Biophys Acta，2009，1793(9):1485－1495.

［8］ Cines DB，Pollak ES，Buck CA，et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders［J］. Blood，1998，91(10):3527－3561.

［9］ Doughan AK，Harrison DG，Dikalov SI. Molecular mechanisms of angiotensin Ⅱ－ mediated mitochondrial dysfunction:linking mitochondrial oxidative damage and vascular endothelial dysfunction［J］. Circ Res，2008，102(4):488－496.

［10］ Levine B，Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease［J］. Cell，2008，132(1):27－42.

［11］ Kabeya Y，Mizushima N，Ueno T，et al. LC3，a mammalian homologue of yeast Apg8p，is localized in autophagosome membranes after processing［J］. EMBO J，2000，19(21):5720－5728.

［12］Mizushima N，Yoshimori T，Levine B. Methods in mammalian autophagy research［J］. Cell，2010，140(3):313－326.

［13］ He C，Klionsky DJ. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy［J］. Annu Rev Genet，2009，43:67－93.

［14］ Blommaart EF，Krause U，Schellens JP，et al. The phosphatidylinositol 3－kinase inhibitors wortmannin and LY294002 inhibit autophagy in isolated rat hepatocytes［J］. Eur J Biochem，1997，243(1－2):240－246.

［15］ Petiot A，Ogier－Denis E，Blommaart EF，et al. Distinct classes of phosphatidylinositol 3＇－kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT－29 cells［J］. J Biol Chem，2000，275(2):992－998.

［16］ Zheng L，Marcusson J，Terman A. Oxidative stress and Alzheimer disease:the autophagy connection?［J］. Autophagy，2006，2(2):143－145.

［17］ Kiffin R，Bandyopadhyay U，Cuervo AM. Oxidative stress and autophagy［J］. Antioxid Redox Signal，2006，8(1－2):152－162.

［18］ De Vries N，De Flora S. N－acetyl－L－cysteine［J］. J Cell Biochem Suppl，1993，17F:270－277.