ATP 竞争性GSK－3 抑制剂对人食管鳞癌细胞多药耐药的影响*

甘思远， 钟雪云， 谢思明， 罗 枫

(1 广东医学院病理学教研室，广东 湛江524023;2 暨南大学医学院病理学教研室，广东 广州510632;3清远市人民医院病理科，广东 清远511518)

目前临床上对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous－cell carcinoma，ESCC)主要采用手术切除结合术后放化疗的治疗方案。随着肿瘤化疗药物的广泛应用，肿瘤治疗过程中产生的耐药性问题越来越突出，已成为肿瘤联合化疗失败的主要原因之一［1］。肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对多种具有不同结构和作用靶位的抗肿瘤药物产生耐药性［2］。研究发现，ATP 结合盒(ATP－binding cassette，ABC)转运蛋白家族成员:ABCB1(ATP－binding cassette，subfamily B，member 1)基因编码的P 糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)、ABCC2(ATP－binding cassette，subfamily C，member 2)基因编码的多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance－associated protein 2，MRP2)通过水解ATP 获得能量依赖性的跨膜药物外排泵的功能，可将抗肿瘤药物逆浓度从细胞内泵出到细胞外，降低细胞内药物浓度并导致肿瘤细胞产生多药耐药(multidrug resistance，MDR)［3－4］。研究发现抗凋亡蛋白B 细胞淋巴瘤－2(B－cell lymphoma－2，Bcl－2)蛋白在肿瘤细胞中高表达，可阻断多种化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡［5］。P－gp、MRP2、Bcl－2 与肿瘤多药耐药密切相关，在肿瘤化疗耐药的发生发展中起着重要作用。

Yamada 等［6］发现，编码P－gp 的ABCB1 基因是Wnt 通路效应元件TCF4/β－catenin 复合物的一个直接目的基因，TCF4/β－catenin 途径的激活可促进P－gp 表达增加。Lim 等［7］研究发现，将与ATP 竞争糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β，GSK－3β)催化活性部位的ATP 竞争性GSK－3 抑制剂6－溴靛玉红－3＇－肟(6－bromoindirubin－3＇－oxime，BIO)作用于细胞会导致β－catenin、P－gp 和MRP2 的表达增加，β－catenin 在胞浆及胞核内出现累积，P－gp 对其底物的转运功能增强，同时还激活了ABCB1 基因的启动子。

本研究将ATP 竞争性GSK－3 抑制剂BIO 作用于ESCC 细胞后，检测β－catenin 与P－gp、MRP2 和Bcl－2 表达之间的关系，细胞内游离ATP 水平的改变对P－gp 转运功能的影响，研究GSK－3β 活性和细胞内游离ATP 能量水平的改变与ESCC 的MDR的关系，以期为肿瘤临床治疗寻找新的靶点。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞来源 人类食管鳞癌细胞系EC－109 由汕头大学医学院馈赠。

1.2 主要试剂 RPMI－1640 培养液购自Gibco;新生胎牛血清购自杭州四季青公司，CY3 标记山羊抗小鼠IgG、BCA 法蛋白质定量测定试剂盒和ATP 检测试剂盒均购自上海碧云天公司;鼠抗人MRP2 单克隆抗体购自Abcam;鼠抗人P－gp 单克隆抗体和鼠抗人β－catenin 单克隆抗体和鼠抗人Bcl－2 单克隆抗体均购自Santa Cruz;罗丹明123 染色试剂盒购自南京凯基公司;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自北京普博欣公司;BIO 购自Sigma。

2 方法

2.1 细胞培养 人类食管鳞癌细胞EC－109 按常规方法培养于含10%小牛血清、1 ×105U/L 含青霉素和100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液完全培养基中，置于5% CO2、37 ℃恒温密闭式培养箱(相对湿度为95%)内，倒置显微镜观察生长情况。约3～4 d 传代1 次，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 细胞处理 EC－109 细胞常规培养后，取对数生长期细胞制备成细胞悬液，将2.8 ×108/L EC－109 细胞1 mL 接种到培养瓶中，48 h 后根据不同组别分别加入2 mL 含不同浓度BIO 药液的RPMI－1640 培养液或无BIO 药液的RPMI－1640 培养液，使BIO 的终浓度分别为1 μmol/L 和2 μmol/L，无药液组为空白对照组(药物剂量的选择参考文献［7－8］)。24 h 后将6 孔板从培养箱内取出，倒置显微镜下观察活细胞形态。

2.3 免疫荧光细胞化学 加入BIO 处理细胞24 h后取出有细胞的盖玻片，PBS 洗5 min ×3 次，丙酮冰上固定细胞10 min，山羊血清封闭75 min，加入适量按适当比例稀释的Ⅰ抗(MRP2、P－gp、β－catenin 和Bcl－2 抗体的稀释浓度均为1∶100)，4 ℃冰箱孵育过夜，滴加适量的Cy3 标记Ⅱ抗(稀释比例1∶100)，室温孵育1 h(避光)，缓冲甘油封片，用PBS 代替Ⅰ抗为阴性对照，其它步骤相同。运用专业CCD 图像采集系统在显微镜下对各实验组的免疫荧光细胞化学结果随机选取5 个以上的200 倍视野进行图像采集。应用Image－Pro Plus 6.0 专业图像分析软件，对所采集的荧光图片进行图像分析，计算阳性区域的平均吸光度(mean absorbance)值;以平均吸光度值代表各蛋白的荧光强度，反映各个蛋白的表达情况。

2.4 罗丹明123 染色试剂盒检测P－gp 转运功能

加入BIO 处理细胞24 h 后常规消化细胞脱壁，细胞悬液离心管内离心，各用PBS 洗涤3 次。将细胞制备成细胞悬液重悬于无血清RPMI－1640 培养基中，细胞计数为1 ×109/L。加入罗丹明123 染液，浓度为4 mg/L，37 ℃、5% CO2细胞培养箱孵育20 min。离心后以PBS 洗涤3 次。重悬细胞于培养基中，37 ℃、5% CO2培养60 min。流式细胞仪检测，激发波长490 nm，发射波长530 nm;荧光显微镜观察，滴加100 μL 上述混合液于载玻片上，激发滤光片波长488 nm，阻断滤光片波长515 nm 观察，拍照。

2.5 ATP 检测试剂盒检测细胞内游离ATP 浓度

加入BIO 处理细胞24 h 后吸除培养液，以PBS 洗涤3 次。6 孔板每孔加入200 μL 裂解液裂解细胞，使用细胞刮刮净6 孔板上的细胞，收集细胞碎片和裂解液于离心管。4 ℃、12 000 ×g 离心10 min，取上清，用于后续的测定。把ATP 标准溶液用ATP 检测裂解液稀释成0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 浓度梯度。加100 μL ATP 检测工作液到检测孔内。室温放置3 ～5 min，以使本底ATP 全部被消耗，从而降低本底。在检测孔内加上50 μL 样品或标准品，迅速用微量移液器混匀，间隔2 s 后，立即用酶标仪检测相对发光单位(relative light unit，RLU)值，同时用酶标仪以562 nm 检测样品的吸光度。根据标准品所测得的RLU 值制作标准曲线，根据ATP标准曲线计算出样品内ATP 的量。BCA 法按试剂盒说明书制作蛋白质标准曲线，根据样品所测得的吸光度计算样品内蛋白质的量。

3 统计学处理

运用SPSS 13.0 软件进行统计学分析。数据以均数±标准差(±s)表示，均数比较采用独立样本t检验或单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 免疫荧光细胞化学结果

与对照组相比，BIO 组β－catenin 和Bcl－2 在胞浆中的表达增强，并且β－catenin 出现胞核内累积(P ＜0.01);MRP2 在胞浆和胞膜中表达增强(P ＜0.01);P－gp 在胞浆和胞膜中表达减弱(P ＜0.01)，见图1、2。

Figure 1. The immunofluorescence cytochemistry showing the expression of MRP2，P－gp，β－catenin and Bcl－2 in EC－109 cells(CY3 staining，×200).图1 免疫荧光细胞化学检测EC－109 细胞内β－catenin、Bcl－2、MRP2 和P－gp 的表达

Figure 2. The mean absorbance of immunofluorescence of β－catenin，Bcl－1，MRP2 and P－gp in ESCC cells. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control group;▲▲P ＜0.01 vs BIO (1 μmol/L)group.图2 ESCC 细胞内β－catenin、Bcl－2、MRP2 和P－gp 免疫荧光的平均吸光度值

2 P－gp 对其转运底物罗丹明123 的转运功能

与对照组相比，1 μmol/L 和2 μmol/L BIO 处理组细胞内罗丹明123 的荧光强度减弱(P ＜0.05)，而这两组之间无显著差别(P ＞0.05)，见图3。

Figure 3. The fluorescence intensity of rhodamine 123 in ESCC cells. ±s.n=4. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L.图3 ESCC 细胞内罗丹明123 的荧光强度

3 ATP 检测试剂盒检测细胞内游离ATP 浓度

2 μmol/L BIO 组细胞内游离ATP 浓度高于1 μmol/L BIO 组和对照组(P ＜0.05)，而1 μmol/L BIO 组与对照组之间无显著差别(P ＞0.05)，见图4。

Figure 4. The free ATP concentration in ESCC cells. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs 0μmol/L or 1 μmol/L.图4 ESCC 细胞内游离ATP 浓度

讨 论

β－catenin 是与细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤发生发展密切相关的Wnt 信号通路的关键信号元件。β－catenin 在胞浆和胞核的蓄积是Wnt 通路被激活的标志。当Wnt 通路被激活时，GSK－3β 的活性受到抑制，β－catenin 泛素化障碍，β－catenin 在胞浆中累积，并进入细胞核，与淋巴细胞增强子或T细胞因子(lymphoid enhancer factor / T cell factor，LEF/TCF)结合，调节目的基因的表达，促进细胞增殖，对抗凋亡，促进肿瘤的发生发展［9］。本研究运用GSK－3 抑制剂BIO 处理食管鳞癌EC－109 细胞后，BIO 组与对照组相比，β－catenin 在胞浆及胞核中的表达增强，并且β－catenin 在胞核内出现累积，与Lim 等［7］和Chang 等［8］的研究结果相符;提示使用BIO 处理ESCC 细胞后，GSK－3β 的活性被抑制，导致β－catenin 的降解发生障碍，从而使β－catenin在细胞浆及胞核内出现累积。而β－catenin 作为TCF/β－catenin 途径的关键信号元件，其在胞浆及胞核中的表达增强，提示TCF/β－catenin 途径被激活。同时，运用BIO 处理食管鳞癌EC－109 细胞后，免疫荧光细胞化学的结果显示，与对照组相比，加药组抗凋亡蛋白Bcl－2 在胞浆中的表达增强。Yan等［10］在ESCC 细胞的研究中发现，STAT3 是TCF/β－catenin 途径的靶基因，随着β－catenin 在胞浆和胞核内的累积，TCF/β－catenin 途径被激活，从而上调STAT3 的表达;同时已有的研究还证实，bcl－2 是STAT3 的靶基因［11］。因此，本研究运用GSK－3 抑制剂BIO 处理食管鳞癌EC－109 细胞，激活TCF/β－catenin 途径后，可能上调EC－109 细胞内STAT3的表达，从而间接上调了Bcl－2 的表达。

本研究运用BIO 处理ESCC 细胞后，与对照组相比，加药组MRP2 在胞浆和胞膜中表达增强，与Lim等［7］的研究结果相符。然而却意外发现P－gp 在胞浆和胞膜中表达减弱，与Lim 等［7］以及Yamada 等［6］的研究结果不相符;提示在ESCC 细胞中，BIO 处理ESCC 细胞激活TCF/β－catenin 途径后，P－gp 的表达还受到其它因素的调控。P－gp 表达与TCF/β－catenin 途径的关系还需继续进行深入的研究。

本研究运用BIO 处理ESCC 细胞后，分别运用流式细胞术检测ESCC 细胞内P－gp 转运底物罗丹明123 在细胞内的荧光强度以及运用ATP 检测试剂盒检测ESCC 细胞内游离ATP 水平。流式细胞术结果显示，与对照组相比，1 μmol/L 与2 μmol/L BIO 组细胞内罗丹明123 的荧光强度减弱，提示使用BIO处理ESCC 细胞后，P－gp 对其作用底物的转运功能增强，与Lim 等［7］的研究结果相符。而2 μmol/L BIO组内的ESCC 细胞内游离ATP 浓度高于1 μmol/L BIO 组以及对照组的ESCC 细胞内游离A1 μmol/L与2 μmol/L BIO 组TP 浓度，提示2 μmol/L BIO 处理ESCC 细胞后，细胞内游离ATP 水平增加。

1 μmol/L BIO 处理ESCC 细胞后，P－gp 在胞浆和胞膜中表达减弱;同时流式细胞术的结果显示，P－gp 介导的转运功能增强。但是由于1 μmol/L BIO组细胞内游离ATP 水平与对照组无显著差别，因此不能判断是否是因为使用BIO 处理ESCC 细胞后，BIO 通过与ATP 竞争GSK－3β 的ATP 结合位点，在抑制GSK－3β 活性的同时，通过改变细胞内游离ATP 水平，使ATP 能量依赖性的ABC 转运蛋白P－gp 的转运功能增强。细胞内游离ATP 水平的改变与ATP 能量依赖性的P－gp 蛋白转运功能之间的关系以及ATP 竞争性GSK－3 抑制剂BIO 对其转运功能的调控机制还需继续进行深入的研究。

MRP2、P－gp 和Bcl－2 与肿瘤MDR 的发生发展密切相关，在肿瘤MDR 的发生发展中起着重要作用。本研究运用BIO 处理ESCC 细胞后，激活了TCF/β－catenin 通路，增加了MRP2 和Bcl－2 的表达，增强了P－gp 对其作用底物的转运功能，提示BIO 处理ESCC 细胞后增强了细胞的MDR。这为进一步阐明ABC 转运蛋白在肿瘤细胞多药耐药中的机制提供了新的思路。

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