补肾健脾化瘀中药对难治/复发再生障碍性贫血患者骨髓CD3+T 淋巴细胞内p-mTOR、p-S6、IFN-γ 表达的影响*

李 锦，华海应△，高华强，朱文艳，周 晔，王志清，张 艳，何广胜

1 江南大学附属医院血液科，江苏 无锡 214041；2 南京医科大学第一附属医院血液科

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一种骨髓造血功能衰竭性疾病，普遍认为AA 是由功能亢进的T 淋巴细胞介导的自身免疫性疾病［1-2］。以免疫抑制治疗(immunosuppressive therapy，IST)为主，应用抗人胸腺细胞球蛋白(antithymocyte globulin，ATG)和环孢素(Cyclosporine A，CsA)方案治疗，疗效约60%～80%，有约30%患者出现复发。目前对于难治/复发AA，除异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）外，尚无统一的有效治疗方案[3]，且allo-HSCT找到人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相合供体少，其次受年龄与身体因素影响，适合者很少，这就迫切需要寻找新的治疗方法。

AA 属中医“虚劳”“血虚”“亡血”等范畴，中医认为血液的生成、运行和功能状态与心、肝、脾、肾有关，与脾、肾关系尤为密切［4-5］。江南大学附属医院采用中西医结合治疗难治/复发AA 常联合补肾健脾化瘀中药，取得了较好疗效，但具体机制尚不明确。

我们前期研究发现，补肾健脾化瘀中药对难治/复发AA 患者骨髓红系集落形成单位（colony forming unit-erythroid，CFU-E）、红系爆式集落形成单位（burst forming unit-erythroid，BFU-E）、粒-巨噬细胞集落形成单位(colony forming unit-granulocyte macrophage，CFU-GM)具有促增殖作用［6］，为进一步探讨具体作用机制，本研究采用补肾健脾化瘀中药、雷帕霉素干预难治/复发AA与初发AA患者骨髓造血细胞，运用流式细胞术检测药物处理前后各组CD3+T 淋巴细胞内磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、磷酸化核糖体蛋白S6(phosphorylated ribosomal protein S6，p-S6)及干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）的表达水平。

1 资料与方法

1.1 临床资料2015 年8 月至2017 年7 月门诊与住院的AA患者28例，其中难治/复发AA 15例中女6 例，男9 例；中位年龄24（12～61）岁；初治AA 13 例中女5 例，男8 例；中位年龄21（9～58）岁。应用CsA 或联合ATG 进行免疫抑制剂治疗，治疗6个月无效视为难治性AA；AA 经正规免疫抑制剂治疗获得缓解后，患者出现外周血细胞计数下降到缓解中位水平的50%以下，或需要输注血制品，如输注红细胞或（和）血小板视为复发AA。同期选取对照组14 例（缺铁性贫血7 例，正常骨髓7 例），其中女6 例，男8 例，中位年龄25（11～62）岁。本研究经南通大学第三附属医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 排除标准1）心、肝、肺、肾功能不全；2）合并其他严重并发症；3）合并恶性肿瘤；4）不能耐受骨穿者；5）对研究药物过敏者。

1.3 研究方法

1.3.1 中药试剂 黄芪多糖（CAS：89250-26-0；规格：20 mg/瓶）、淫羊藿甙（CAS：489-32-7；规格：50 mg/瓶）、三七总皂甙（CAS：88105-29-7；规格：50 mg/瓶）、人参二醇（CAS：7755-01-3；规格：20 mg/瓶）均由南京景竹生物技术有限公司提供，质量分数分别为：70%、≥85%、90%及95%；巴戟天多糖（CAS：59432-60-9；规格：50 mg/瓶）、菟丝子黄酮（CAS：190801；规格：20 mg/瓶）、黄精多糖（CAS：S27804；规格：50 mg/瓶）、当归多糖（CAS：A22001；规格：20 mg/瓶）均由陕西斯诺特生物技术有限公司提供，质量分数分别为≥95%、90%、85%、90%。

1.3.2 骨髓采集与分组处理 在无菌条件下采集受试者骨髓液5 mL，缓慢注入含肝素抗凝无菌试管中，并摇匀。将对照组、初发AA、复发/难治AA 3 组受试者骨髓标本分别置于24 孔培养板中，每组设本底组（空白组）、雷帕霉素组和补肾健脾化瘀中药组。雷帕霉素组加入终浓度25 nmol/L的雷帕霉素；中药组加入当归多糖、淫羊藿甙、巴戟天多糖、黄芪多糖、三七总皂甙、黄精多糖各100 μg/mL及菟丝子黄酮、人参二醇各50 μg/mL；空白组加入生理盐水。每孔1 mL，每组设3 个复孔。每孔分别加入含10%胎牛血清RPMI 1640 培养基至1 mL，置于5%CO2、37 ℃培养箱孵育48 h。

1.3.3 p-mTOR、p-S6、IFN-γ水平检测 用免疫磁珠分选对照组、初发AA、复发/难治AA各组药物处理前后（培养箱孵育48 h）骨髓单个核细胞的CD3+T 淋巴细胞，各组加入破膜剂进行T 淋巴细胞破膜，分别加入抗p-mTOR、抗p-S6与FITC-IFN-γ，以CD3+T 淋巴细胞为横坐标，细胞计数为纵坐标，形成直方图，获得5000 个以上CD3+T 淋巴细胞数，上流式细胞仪分析CD3+T 细胞胞浆内的p-mTOR、p-S6及IFN-γ表达，以阳性细胞百分数表示。

1.4 统计学方法应用SPSS 11.0 软件分析数据，计量资料以D表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用成组设计t检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR 表达实验中CD3+T 淋巴细胞的纯度均为94%以上，药物处理前，复发/难治AA 患者CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR表达均高于初发AA及对照组（P＜0.01），而初发AA与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。药物处理后，复发/难治AA 组中雷帕霉素及补肾健脾化瘀中药均能降低CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR 表达（P＜0.01），雷帕霉素与补肾健脾化瘀组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；初发AA 与对照组中，雷帕霉素、补肾健脾化瘀中药降低CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR 表达不明显（P＞0.05）。见表1及图1。

表1 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内p-mTOR的表达（D）%

表1 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内p-mTOR的表达（D）%

注：*表示与对照组比较，P＜0.01；△表示与复发/难治AA组药物处理前比较，P＜0.01

图1 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内p-mTOR的表达（流式细胞）

2.2 CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-S6 的表达药物处理前，复发/难治AA 患者CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-S6 表达均高于初发AA 及对照组（P＜0.01），而初发AA与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。药物处理后，复发/难治AA组中，雷帕霉素及补肾健脾化瘀中药能降低CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-S6 表达（P＜0.01），雷帕霉素与补肾健脾化瘀中药组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；初发AA与对照组中，雷帕霉素、补肾健脾化瘀中药降低CD3+T淋巴细胞胞浆内p-S6 表达不明显（P＞0.05）。见表2及图2。

图2 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内p-S6的表达（流式细胞）

表2 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内p-S6的表达（D）%

表2 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内p-S6的表达（D）%

注：*表示与对照组比较，P＜0.01；△表示与复发/难治AA组药物处理前比较，P＜0.01

2.3 CD3+T 淋巴细胞胞浆内IFN-γ 表达药物处理前，复发/难治AA 患者CD3+T 淋巴细胞胞浆内IFN-γ表达均高于初发AA及对照组（P＜0.01），初发AA 患者IFN-γ表达高于对照组（P＜0.01）。药物处理后，复发/难治AA 组中，雷帕霉素及补肾健脾化瘀中药能降低CD3+T淋巴细胞胞浆内IFN-γ表达（P＜0.01）；初发AA 组中，雷帕霉素及补肾健脾化瘀中药均能降低CD3+T淋巴细胞胞浆内IFN-γ表达（P＜0.01），雷帕霉素与补肾健脾化瘀中药组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组中，雷帕霉素及补肾健脾化瘀中药降低CD3+T 淋巴细胞胞浆内IFN-γ表达作用不明显（P＞0.05）。见表3及图3。

图3 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内IFN-γ的表达（流式细胞）

表3 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内IFN-γ的表达（D）%

表3 各组骨髓CD3+T淋巴细胞胞浆内IFN-γ的表达（D）%

注：*表示与对照组比较，P＜0.01；▲表示与初发AA组药物处理前比较，P＜0.01；△表示与复发/难治AA组药物处理前比较，P＜0.01

3 讨论

肾主骨生髓，藏精，精血互化，肾精亏虚，骨髓失于充养，不能化生气血，以致唇甲淡白、面色萎黄、气短、心悸、乏力，脑失滋养，导致耳鸣、头晕、健忘；骨髓空虚，腰府失养，致使气虚无力推动血脉运行，腰膝酸软；血虚则血行不畅，导致离经之血不去，瘀阻络脉，致使皮肤瘀点或瘀斑；瘀血不去，新血不能生，致病情缠绵难愈。因此肾精亏虚、气血不足、瘀血内阻是AA 的重要病机，治疗宜采用补肾中药。研究显示，补肾阴、补肾阳及健脾化瘀中药治疗AA已取得一定疗效［7］。临床用于治疗AA 的补肾阳中药包括菟丝子、淫羊藿、巴戟天等，菟丝子黄酮可通过补肾促进幼年大鼠睾丸支持细胞增殖和分化［8］；用于治疗AA 的补肾阴中药有熟地黄、黄精等，熟地黄多糖、黄精多糖均具有调节免疫功能的作用［9］；淫羊藿苷具有雌激素样作用，有调节免疫、抗炎、壮阳等功效［10］；巴戟天多糖具有增强机体免疫，改善生殖功能等作用［11］；用于治疗AA 的益气养血中药有人参、当归、黄芪等，人参二醇能有效促进造血功能，改善AA 患者骨髓抑制，加快造血功能恢复，升高外周血象，同时通过恢复AA 小鼠失衡的Th1/Th2/Treg 细胞比例而调节免疫功能［12］；黄芪多糖对小鼠有免疫功能调节作用，还可刺激B 细胞的活化与增殖来增高机体体液免疫能力［13］。当归多糖可防护X 线损伤大鼠骨髓及脾脏，促进血细胞增殖［14-15］；用于治疗AA的活血药物有三七等，三七总皂甙通过促进骨髓与骨髓间充质细胞分化，促进血细胞与间充质细胞生成［16］。

本研究采用补肾健脾化瘀中药（当归多糖、淫羊藿甙、巴戟天多糖、黄芪多糖、三七总皂甙、黄精多糖，菟丝子黄酮、人参二醇）兼补肾阴、肾阳，健脾化瘀。本研究发现，药物处理前，复发/难治AA患者CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR、p-S6、IFN-γ表达均高于初发AA 及对照组；药物处理后，在难治/复发AA 组中，雷帕霉素及补肾健脾化瘀中药均能降低CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR、p-S6、IFN-γ表达，雷帕霉素组与补肾健脾化瘀中药组比较差异无统计学意义。既往研究发现复发/难治AA 患者对CsA 耐药与CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR/p-S6/IFN-γ异常活化有关，对雷帕霉素敏感与雷帕霉素靶向抑制CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR/p-S6/IFN-γ异常活化有关，雷帕霉素通过不同的机制作用环孢菌素治疗免疫介导的AA［17-18］。本研究结果进一步证实了补肾健脾化瘀中药与雷帕霉素均能通过抑制复发/难治AA患者CD3+T淋巴细胞胞浆内p-mTOR、p-S6、IFN-γ表达，抑制T 淋巴细胞活性，降低造血负调控因子，促进造血功能重建。此研究结果在国内外未见相关报道，与雷帕霉素比较未显示明显优势，但补肾健脾化瘀中药可以减少雷帕霉素不良反应，为补肾健脾化瘀中药临床治疗复发/难治AA 患者提供了一定的理论基础。

综上所述，补肾健脾化瘀中药通过抑制难治/复发AA 患者CD3+T 淋巴细胞胞浆内p-mTOR、p-S6、IFN-γ表达，进而抑制T 淋巴细胞异常激活，改善骨髓造血功能。今后将进一步研究补肾健脾化瘀中药联合CsA治疗难治/复发AA，判断补肾健脾化瘀中药克服CsA 耐药后的疗效是否明显提高，且具体作用机制及是否通过其他途径发挥作用也有待进一步研究。