MDR1 基因沉默增强三尖杉酯碱诱导的HT9 细胞凋亡*

张伟伟， 邵淑丽， 张珍珠， 付 博

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔161006)

三尖杉酯碱(harringtonine，HT)是从海南粗榧属植物中提取的抗肿瘤药物，具有细胞毒、DNA 合成抑制及染色体损伤等作用［1－2］，能诱导白血病细胞HL60 凋亡［3－7］。但在治疗中，白血病和肿瘤细胞的药物不敏感性或耐药性的产生，往往导致治疗的失败。肿瘤多药耐药产生的机制较为复杂，包括ATP结合转运蛋白家族成员的过表达［8］、拓扑异构酶II活性的改变、谷胱甘肽－S－转移酶的修饰［9］、细胞凋亡抑制基因bcl－2［10］的过表达及p53 基因的突变等。其中，ATP 结合转运蛋白家族成员多药耐药(multidrug resistance，MDR)基因的过表达成为经典的多药耐药表型［11］，在近50%的人类癌症中存在高表达。P－糖蛋白(P－glycoprotein)又称多药耐药蛋白1(multidrug resistance protein 1，MDR1)可以利用ATP 水解释放的能量将化疗药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度始终维持在低水平，减弱药物的细胞毒作用，从而导致细胞对结构和作用机制不同的多种药物产生耐药性。本实验利用RNA 干扰的方法，设计1 条靶向MDR1 的shRNA，稳定转染HT9 细胞后，检测HT9 细胞对三尖杉酯碱的敏感性，探讨靶向MDR1 基因的shRNA 对三尖杉酯碱诱导的HT9细胞凋亡的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

质粒pSilencer 3.1－H1 neo 购自北京鼎国生物公司，敏感的和耐三尖杉酯碱的人白血病细胞株HL60 和HT9 来源于北京师范大学生命科学学院，RPMI－1640培养基、胎牛血清(上海生工);C219 抗体(Signet)，β－actin 抗体(Signet)，IgG (Jakson ImmunoResearch Lab)，ECM830 型电穿孔仪(BTX);荧光定量PCR 仪(ABI PRISM 7700);流式细胞仪FC500(贝克曼)，激光共聚焦显微镜 (Olympus FV500)。

2 方法

2.1 MDR1 shRNA 表达载体的构建 根据GenBank MDR1 mRNA 的已知序列(NM_000927)，选择shRNA 特异性靶位点序列。设计合成MDR1 shRNA 的DNA 模板，将其定向克隆到pSilencer 3.1－H1 neo 载体上，shRNA 表达质粒命名为pSilencer 3. 1－MDR1。连接产物转化，提取质粒，测序鉴定。以含随机序列的pSilencer 3.1－H1 neo 质粒为阴性对照。

2.2 细胞的培养及转染 细胞均用含10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期的HT9 细胞，通过pEGFP－N1质粒优化电转染条件，线性化的重组质粒于最佳电转染条件下电转染HT9 细胞，用600 mg/L G418 筛选建立稳定表达siRNA 的HT9 细胞克隆。有限稀释法挑取单克隆转染细胞分别得到HT9/sh－3. 1(转染pSilencer 3.1－H1 neo)和HT9/sh－3. 1－1(转染pSilencer 3.1－MDR1)。

2.3 实时荧光定量PCR 检测MDR1 mRNA 采用UNIQ－10 柱式Trizol 总RNA 抽提试剂盒(Sangon)提取细胞总RNA。MDR1 正义链ATATCAGCAGCCCACATCAT，反义链GAAGCACTGGGATGTCCGGT，扩增产物为154 bp。以β－actin 为内参照，β－actin正义链 ATCATGTTTGAGACCTTCAACA，反义链CATCTCTTGCTCGAAGTCCA，扩增产物为318 bp。实时荧光定量PCR 扩增条件:94 ℃3 min，94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃1 min，循环35 次，72 ℃检测信号，循环结束后进行熔解曲线检测。实验重复3次，数据以2－ΔΔCt)进行计算。

2.4 Western blotting 检测MDR1 蛋白的表达 收集未转染和稳定转染重组质粒的HT9 细胞，提取总蛋白，样品进行SDS－PAGE 凝胶电泳，用Bio－Rad 电转仪将蛋白转移到PVDF 膜上，转膜条件为150 V 恒压3 h，5%脱脂奶粉封闭1h，加C219 Ⅰ抗(1∶100)，内参照β－actinⅠ抗4 ℃孵育过夜，PBS 洗膜，加Ⅱ抗IgG(1∶10 000)，室温孵育2 h，ECL 发光液发光成像，用凝胶图像分析软件分析灰度值。

2.5 MTT 法检测耐药逆转效果 细胞中分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/L 三尖杉酯碱，常规MTT 法检测，测得实验组细胞和耐药细胞的存活率，570 nm 下测吸光度(A)。细胞存活率(%)=A(实验组)/A(对照组)×100%，以药物浓度为横轴，细胞存活率为纵轴绘制浓度效应曲线，求出回归方程，确定半数抑制浓度(IC50)并计算相对逆转率，实验重复3 次。

2.6 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 细胞中加入1.0 mg/L 三尖杉酯碱作用24 h 后，按照凋亡细胞DNA 提取试剂盒(上海生工)说明书提取各组细胞DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 片段化。

2.7 激光共聚焦显微镜观察细胞内染色体形态结构

细胞中分别加入1.0 mg/L 三尖杉酯碱作用24 h后，800 r/min 离心10 min 收集细胞，预冷的PBS 洗3次，0.5 g/L 吖啶橙(acridine orange，AO)37 ℃孵育10 min。激光共聚焦显微镜观察细胞内染色体形态。

2.8 流式细胞仪检测细胞周期 细胞中分别加入终浓度为1.0 mg/L 三尖杉酯碱作用24 h 后，800 r/min 离心10 min 收集细胞，加入1 mL－20 ℃预冷的70%乙醇，充分混匀，4 ℃保存，固定至少18 h，调整细胞浓度为1 ×109/L，取1 mL 细胞悬液，用PBS 洗3 次，细胞重悬于1 mL 含20 mg/L RNase A 和50 mg/L PI 的染液中，37 ℃孵育30 min，流式细胞仪检测(汞激发波长为488 nm)。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据处理，进行单因素方差分析(One－way ANOVA)，组间比较用LSD 法检测其差异性，数据以均数±标准差(±s)表示，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 MDR1 shRNA 表达载体的鉴定

经测序结果鉴定，重组质粒的碱基序列与预期结果一致，重组质粒构建成功，见图1。

Figure 1. The analysis of target sequence in the recombinant plasmid.图1 重组质粒pSilencer 3.1－MDR1 中shRNA 的序列分析

2 pEGFP－N1 质粒优化电转染条件

电转染时间定为30 ms，分别调节电压为240 V、250 V、260 V、270 V、280 V 和290 V 进行电转染条件的摸索。结果显示，电压为280 V 时，细胞存活率在40% ～50%之间，有约70%的细胞发绿色荧光，见图2，因此，确定脉冲时间30 ms、电压280 V 为电转染HT9 细胞的最佳条件。

Figure 2. The expression of green fluorescent protein in HT9 cells (× 200). A:under phase－contrast microscope;B:under fluorescence microscope.图2 绿色荧光蛋白在HT9 细胞中表达

3 荧光定量PCR 检测MDR－1 mRNA 的表达

应用定量PCR 仪自带数据分析软件获得Ct 计算出各组细胞MDR－1 mRNA 表达值，计算各实验组细胞MDR1/β－actin 的值。结果表明，重组质粒pSilencer 3.1－MDR1 可以显著降低HT9 细胞MDR1 mRNA 的表达，单克隆细胞HT9/sh－3. 1－1 的MDR1/β－actin mRNA 比值明显降低，与HT9 细胞相比单克隆细胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 mRNA 的表达降低了75.4%(P ＜0.01)，见图3。

4 Western blotting 检测MDR1 蛋白的表达

重组质粒pSilencer 3.1－MDR1 可以显著降低HT9 细胞DMR1 蛋白的表达，单克隆细胞HT9/sh－3. 1－1的MDR1/β－actin比值明显降低，与HT9细胞相比单克隆细胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 蛋白的表达降低了41.13%(P ＜0.05)，见图4。

Figure 3. The expression level of MDR1 mRNA in different cells.±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs HT9;△P ＜0.05 vs HT9/sh－3.1－1.图3 各组细胞中MDR1 mRNA 的表达水平

5 多药耐药逆转效果

MTT 检测显示，与HT9 细胞相比，稳定表达阳性单克隆细胞HT9/sh－3.1－1 抗肿瘤药的IC50显著降低(P ＜0.01)，见表1。

6 三尖杉酯碱作用后各组细胞的DNA 片段化

提取细胞基因组DNA，进行常规的琼脂糖凝胶电泳，凋亡细胞的DNA 显示出180 ～200 bp 及其不同倍数的梯带，这被视为最典型的凋亡指标。DNA凝胶电泳结果显示，与HT9 细胞相比，稳定表达阳性单克隆细胞HT9/sh－3.1－1 的DNA ladder 更明显，细胞染色质DNA 裂解成180 ～200 bp 大小不等的片段，而HT9/sh－3.1 细胞则没有出现凋亡细胞特有的梯带，见图5。

7 三尖杉酯碱对各组细胞形态的影响

Figure 4. The expression level of MDR1 protein in different cells. ±s.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs HT9;△P ＜0.05 vs HT9/sh－3.1－1.图4 各组细胞中MDR1 蛋白的表达水平

表1 三尖杉酯碱作用24 h 后各组细胞的IC50Table 1. The IC50 of harringtonine for different cells (±s.n=3)

表1 三尖杉酯碱作用24 h 后各组细胞的IC50Table 1. The IC50 of harringtonine for different cells (±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs HT9.

Group IC50(mg/L) Reversal fold Reversal rate(%)HT9 1.184±0. 130 104.78±6.57—HT9/sh－3.1 1.128±0. 160 99.78±7.41 4.817±1.390 HT9/sh－3.1－1 0.711±0.010＊＊ 62.91±2.96＊＊ 40.350±2.810 HL60 0.011±0.019＊＊—

Figure 5. Comparison of DNA ladder in different cells.M:DNA marker;1:HT9 cells;2:HT9/sh－3. 1 cells;3:HT9/sh－3.1－1 cells;4:HL60 cells.图5 各组细胞DNA ladder 的比较

各组细胞经三尖杉酯碱处理，用吖啶橙染色后在激光共聚焦显微镜下观察，如图6 所示，HL60 细胞呈现明显的凋亡特征，染色质高度凝集和边缘化，细胞质出泡，出现凋亡小体，见图6A;稳定转染的HT9/sh－3.1－1 细胞胞核呈现大小不等、形态不规则的碎片状或梅花状，为典型的细胞凋亡形态，见图6D，HT9 细胞和HT9/sh－3.1 细胞未出现明显的凋亡形态。

8 三尖杉酯碱对细胞周期的阻滞作用

HT9、HT9/sh－3.1、HT9/sh－3. 1－1 和HL60细胞经三尖杉酯碱诱导24 h 后收集，流式细胞仪检测，结果表明，与HT9 细胞相比，HT9/sh－3.1 细胞的细胞周期未发现显著变化，HT9/sh－3.1－1 细胞的S 期细胞增多，并出现明显的凋亡亚峰，见图7。

讨 论

白血病是最常见的造血系统恶性肿瘤之一，目前联合化疗仍然是白血病治疗的重要措施，而白血病细胞多药耐药的产生则使部分白血病的化疗最终归于失败。随着耐药机制研究的一步步深入，各种耐药逆转剂等也不断涌现，主要包括基因治疗［12］、免疫疗法［13］和药物治疗。其中RNA 干扰是近年来发展起来的一项特异性抑制基因表达的基因治疗方法。RNA 干扰最主要的功能是调节和关闭特定基因的表达进而调控细胞的各种高级生命活动。这一特异、有效的基因沉默技术现已被广泛应用于白血病多药耐药等方面的研究。张敏等［14］研究了靶向mdr1 4个不同位点的siRNA 对耐药细胞MDR 的逆转效果，结果显示4 条siRNA 转染72 h 后K562/A02 细胞对ADR 的敏感性增强，相对逆转率依次为90.61%、54.27%、96. 39% 和85. 32%。邵淑丽等［15］针 对MRP1 基因构建了2 个shRNA 表达载体转染肺癌细胞株A549/DDP 后MRP1 mRNA 和MRP1 蛋白表达均显著降低，细胞内Rho123 相对荧光强度明显提高;转染后细胞对DDP 的IC50和对5－FU 的IC50均显著降低，有效逆转了A549/DDP的多药耐药。本实验成功构建了shRNA 表达载体pSilencer 3. 1－MDR1，稳定转染后，经荧光定量PCR 和Western blotting 检测，与HT9 细胞相比单克隆细胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 mRNA 的表达降低了75.4%(P ＜0.01)，MDR1 蛋白的表达降低了41.13%(P ＜0.05)。夏忠胜等［16］在结肠癌细胞的研究中得到相似结果。众所周知，MDR1 能将化疗药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度始终维持在低水平，减弱药物的细胞毒作 用。经 载 体p Silencer3. 1－H1 neo－MDR1 转 染后，单克隆细胞HT9/sh－3.1－1 中MDR1 的表达显著降低，三尖杉酯碱的IC50亦显著降低，相对逆转率为40.35%。这为后续细胞凋亡研究打下基础。

Figure 6. Morphology of the chromatin in the cells treated with harringtonine under laser confocal microscope(acridine orange staining，×400).A:HL60 cells;B:HT9 cells;C:HT9/sh－3.1 cells;D:HT9/sh－3.1－1 cells.图6 激光共聚焦下各组细胞染色质的形态

Figure 7. Apoptosis of the cells treated with harringtonine detected by flow cytometry. A:HL60 cells;B:HT9 cells;C:HT9/sh－3.1－1 cells;D:HT9/sh－3.1 cells.图7 流式细胞术检测各组细胞凋亡

在获得稳定转染pSilencer 3.1－MDR1 重组质粒的阳性单克隆细胞后，我们检测了HT9 细胞和单克隆细胞HT9/sh－3.1－1 对三尖杉酯碱的敏感性。结果表明，与HT9 细胞相比，稳定表达阳性单克隆细胞HT9/sh－3.1－1 的DNA ladder 更明显，细胞染色质DNA 裂解成180 ～200 bp 大小不等的片段;在激光共聚焦显微镜下，经三尖杉酯碱处理的HT9 细胞和HT9/sh－3.1 细胞染色质分布均匀，而HT9/sh－3.1－1 细胞染色质浓缩，出现形态不规则的碎片状或梅花状等典型的细胞凋亡形态;另外，利用流式细胞术研究三尖杉酯碱对细胞周期的影响，结果显示HT9/sh－3.1－1 细胞的S 期细胞增多，并出现明显的凋亡峰，HT9 和HT9/sh－3.1 细胞的细胞周期未发现显著变化。综上所述，利用RNA 干扰技术沉默MDR1 基因表达能有效增加多药耐药细胞HT9 对三尖杉酯碱的敏感性，增强三尖杉酯碱诱导的HT9 细胞凋亡。

［1］ 潘震昆，韩 锐，王永潮. 三尖杉酯碱对白血病L－1210 细胞杀伤动力学研究:I. 放射自显影观察［J］. 生物化学与生物物理学报，1980，12(1):13－20.

［2］ 潘维林，王端顺，王永潮. 用早熟染色体凝集(PCC)法和克隆培养法研究三尖杉酯碱对CHO 细胞杀伤动力学［J］. 中华肿瘤杂志，1983，5(4):256－259.

［3］ Fang M，Zhang HQ，Xue SB. Apoptosis of HL60 cells induced by Harringtonine:membrane blebs，nucleus blebs and chromatin condensation ［J］. Acta Biol Exp Sin，1996，29(3):221－233.

［4］ 孟凡宏，何琪杨，池旭生，等.人白血病HL60 细胞的分化状态对细胞凋亡的影响［J］.药学学报，1997，32(7):496－501.

［5］ 刘 影，方基勇，吴明彩，等. 低分子RNA 与高三尖杉酯碱联用对白血病细胞系HL－60 细胞作用的实验观察［J］.皖南医学院学报，2006，25(3):167－169.

［6］ 李 程，曹丽芝，万恂恂，等. 三尖杉酯碱对HL60 细胞凋亡及原癌基因表达的影响［J］. 中国病理生理杂志，2001，17(2):107，119.

［7］ 陈春燕，贾继辉，潘祥林，等. 高三尖杉酯碱对HL60 细胞凋亡的影响及机制的研究［J］. 中国病理生理杂志，2004，20(7):1183－1186.

［8］ Borel F，van Logtenstein R，Koornneef A，et al. In vivo knock－down of multidrug resistance transporters ABCC1 and ABCC2 by AAV－delivered shRNAs and by artificial miRNAs［J］. J RNAi Gene Silencing，2011，7:434－442.

［9］ Marquez B，Caceres NE，Mingeot－Leclercq MP，et al.Identification of the effux transporter of the fluoroquinolone antibiotic ciprofloxacin in murine macrophages:studies with ciprofloxacin－resistant cells［J］. Antimicrob Aagents Chemother，2009，53(6):2410－2416.

［10］ Kim DW，Kim KO，Shin MJ，et al. siRNA－based targeting of antiapoptotic genes can reverse chemo－resistance in P－glycoprotein expressing chondrosarcoma cells［J］.Mol Cancer，2009，8 (1):28－38.

［11］ Pan GD，Yang JQ，Yan LN，et al. Reversal of multidrug resistance by pSUPER－shRNA－mdr1 in vivo and in vitro［J］.World J Gastroenterol，2009，15(4):431－440.

［12］ Rumpold H，Wolf AM，Gruenewald K，et al. RNAi－mediated knockdown of P－glycoprotein using a transposon－based vector system durably restores imatinib sensitivity in imatinib－resistant CML cell lines［J］. Exp Hematol，2005，33(7):767－775.

［13］ Niethammer AG，Wodrich H，Loeffler M，et al. Multidrug resistance－1 (MDR－I):a new target for T cellbased immunotherapy［J］. FASEB J，2005，19(1):158－ 159.

［14］ 张 敏，李勇莉，高建凯，等. 靶向mdr1 不同位点的siRNA 对两种耐药细胞MDR 的逆转效果［J］. 世界华人消化杂志，2009，17(33):3387－3393.

［15］ 邵淑丽，崔婷婷，贾红双，等. 靶向MRP1 基因的shRNA 稳定逆转肺癌的多药耐药性［J］.中国病理生理杂志，2011，27(12):2265－2269.

［16］ 夏忠胜，朱兆华，陈其奎，等. 靶向MDR1 基因的RNAi稳定逆转结肠癌细胞的多药耐药性［J］.中国病理生理杂志，2009，25(5):898－903.