醇提红曲对去势骨质疏松模型大鼠的影响及作用机制

杨 栋， 张剑宇

(1山西省中西医结合医院内分泌科， 太原 030013;2*山西医科大学第二临床医学院中医科;*通迅作者，E-mail:ydd_spring@163.com)

绝经后骨质疏松症是一种高转换型骨病，主要是由于女性绝经后雌激素水平下降导致骨吸收与骨形成同时亢进，骨吸收超过骨形成，骨重建失衡引起骨量减少所致。我国是世界上人口最多的国家，老龄化的速度比欧美国家明显加快，绝经后骨质疏松症引起严重的医疗和社会负担，如何早期防治绝经后骨质疏松症成为亟待解决的公共卫生问题。Mundy等［1］提出，广泛应用于防治心血管疾病的药物－他汀类降血脂药同时具有预防骨质疏松症的作用，其作用机制之一就是抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶。李永国等［2］发现，红曲中具有12种他汀类成分;而卢建华等［3］对去卵巢大鼠实验研究表明红曲具有治疗骨质疏松的作用。为了进一步证实红曲对骨质疏松的作用，探讨红曲对于骨代谢的作用机制，进行以下研究。

图1 12周末各组大鼠骨形态学观察(10×10)Fig 1 Morphological changes of bone at the end of 12 weeks(10×10)

1 材料与方法

1.1 实验药物及试剂 红曲，山西省中医药研究院提供;降钙素(商品名密盖息)，北京诺华制药有限公司，药品注册证号:H20040452;大鼠OPG定量，ELISA试剂盒，上海麦莎生物科技有限公司;碱性磷酸酶测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 试剂与仪器 粉碎机型号FW177，转速24 000 r/min，山西医科大学药学院提供;旋转蒸发器型号RE-52AA上海亚荣生化仪器厂生产，山西医科大学药学院提供;双能X线骨密度仪EXCELL型号XRN-433A025，美国NORLAND公司生产(动物全身测量软件)。

1.3 实验动物 Wistar大鼠，雌性，体重180－250 g，山西医科大学实验动物中心供应，清洁级，饲养标准严格控制在室温18－22℃、湿度45%－65%。

1.4 动物分组及造模 32只6月龄雌性Wistar大鼠随机分为4组:假手术组、红曲组、降钙素组、模型组，每组8只;0.25%戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射麻醉动物，采用背侧切口，无菌条件下切开皮肤、皮下组织，红曲组、降钙素组、模型组切除卵巢，假手术组只切除卵巢周围少量脂肪组织，逐层缝合。术后连续3 d肌注青霉素注射液，均给普通饲料，自由饮食［4，5］。

1.5 实验方法

1.5.1 提取红曲 粉碎红曲，细度100目;精确称取红曲，每克用75%乙醇25 ml溶解，静置10 h;使用超声波振荡仪，功率150 W，水温60℃，超声振荡30 min;水浴氮气条件下使用旋转蒸发器蒸去乙醇，水温控制在60℃，红曲醇提液浓缩至原体积1/10，4 ℃密闭保存［6，7］。

1.5.2 给药 术后1周给药，红曲组、降钙素组、模型组分别予以红曲醇提液灌胃(红曲3.3 g/kg)、降钙素皮下注射(6.6μg/kg)、生理盐水灌胃，连续给药12周(根据人鼠体表面积换算系数，用药量相当于成人每天每千克体重用量的20倍)，假手术组组无特殊处理。于术后1，6，12周重复测量大鼠左侧股骨骨密度。骨密度扫描的部位包括全股骨和胫骨上端，扫描前水合氯醛腹腔注射，麻醉后使大鼠处于俯卧位，后肢维持在外旋位，股骨与胫骨呈45°角［8］。扫描重复3次，每次重置大鼠。

1.5.3 大鼠OPG［9］、ALP测定 术后12周20%乌拉坦按1 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露大鼠腹主动脉，普通采血管取血，4℃低温离心取血清;采用ELISA－竞争法测定OPG。采用紫外可见分光光度仪比色法测量ALP。

1.5.4 骨切片的制备［10］术后12周，剥离左后肢股骨，去除附着的软组织，立即放入10%福尔马林中固定24 h，脱钙，石蜡包埋，常规组织学切片，HE染色，光镜下观察骨小梁形态结构。

1.6 统计学分析 应用SAS9.0统计软件，计数资料数据采用±s表示;骨密度和体重资料利用重复测量两因素方差分析;OPG及ALP资料利用单因素方差分析和SNK-q检验;OPG与BMD、ALP之间的相关性分析采用直线相关分析。

2 结果

2.1 一般状态变化 各组大鼠切除卵巢6周后逐渐出现不同程度的活动减少、挨挤喜卧、反应迟钝，或易激惹、拱背、竖毛、毛色变黄等现象，模型组最为明显，红曲组症状较轻，各组去卵巢大鼠的摄食、饮水量均较假手术组增多。各组大鼠切除卵巢6周之前较假手术组无明显变化。至实验结束各组大鼠各有1只死亡。

2.2 醇提红曲对去势骨质疏松的影响 不同干预方法对去势大鼠间骨密度影响存在组间差异(P=0.019 9)，大鼠骨密度值在不同干预方法下不同时间的趋势也不同(P＜0.000 1)。给药1周末及6周末四组去势大鼠间骨密度比较差异无统计学意义，12周末总体有统计学差异(见表1)。术后12周红曲组BMD高于模型组，但低于降钙素组及假手术组(均 P＜0.05)。

表1 醇提红曲对去势骨质疏松大鼠骨密度的影响 (mg/cm2)Tab 1 Effect of alcohol extract of monascus on bone mineral density，osteoprotegerin，alkaline phosphatase in ovariectomized rats(mg/cm2)

给药12周末各组间大鼠OPG水平(P=0.005 1)和ALP(P＜0.000 1)均存在统计学差异。红曲组OPG高于模型组及假手术组，但低于降钙素组(均P＜0.000 1，见表2);红曲组ALP高于降钙素组及假手术组，但低于模型组(均P＜0.000 1)。

表2 12周末醇提红曲对去势骨质疏松大鼠OPG和ALP的影响Tab 2 Effect of alcohol extract of monascus on osteoprotegerin，alkaline phosphatase in ovariectomized rats at the end of 12 weeks

给药12周末去势骨质疏松大鼠BMD与OPG呈正的直线相关关系(r=0.381 67，P=0.031 1)，与ALP呈负的直线相关关系(r=－0.660 48，P＜0.000 1)。

2.3 骨形态学 假手术组:股骨骨小梁结构呈网孔状，连接紧密，排列规则，骨小梁壁厚度一致(见图1A，见第240页)。模型组:股骨骨小梁大片消失，髓腔内残留纽扣样或棒状骨小梁结构，骨小梁连接断裂，排列疏松(见图1B，见第240页)。降钙素组:股骨骨小梁结构连接较紧，排列有规则，小梁间相互呈网状，骨小梁各壁厚度较为一致(见图1C，见第240页)。红曲组:股骨骨小梁结构连接较紧，小梁间相互呈网状，骨小梁各壁厚度较一致(见图1D，见第240页)。

3 讨论

妇女雌激素水平下降，骨代谢增加，骨吸收超过骨形成，导致骨密度(BMD)下降，形成绝经后骨质疏松症。本次实验各组BMD基线总体无差异，去势术后12周模型组BMD低于假手术组，血清ALP含量明显高于假手术组，模型组骨切片股骨骨小梁大片消失，说明去势大鼠模型较好模拟了绝经后骨质疏松骨量降低、骨微结构破坏、高转换率的特点。经治疗后红曲组较模型组大鼠BMD下降减缓，骨量增加，ALP降低，BMD和ALP有负的直线相关关系，说明红曲具有促进骨形成、抑制骨吸收，降低骨代谢率的作用。红曲是一味传统中药，是首先发现并研究的具有降脂作用的中药，红曲含有多种天然他汀，他汀类药物除降低血脂外，可通过多条途径影响成骨细胞和破骨细胞的活性，具有治疗和预防骨质疏松的作用。他汀类药物可以抑制HMG-CoA还原酶活性，阻碍下游类异戊二烯脂合成，抑制蛋白质异戊烯化。异戊烯化信号分子对破骨细胞的功能有重要影响。Hughes等研究发现，他汀类药物导致体外兔破骨样细胞及巨噬细胞中非异戊二烯化Rap-1 A的累积，并且抑制破骨细胞活性，这表明他汀类药物通过抑制破骨细胞介导的骨重吸收起作用的［11，12］。卢建华等关于红曲对去卵巢大鼠实验研究表明，红曲能明显增加骨中BMP-2的表达，推测红曲能促进间充质细胞分泌BMP-2，并促使其向成骨细胞转化，从而加速骨形成，具有治疗OP的作用［13］，同时红曲具有体外促进成骨细胞增殖、分化及矿化的功能［14］。相关文献较多关注于红曲对于成骨细胞方面的研究，对于破骨细胞方面的探讨较少。OPG/RANKL/RANK系统是破骨细胞的分化、活化、成熟及凋亡过程中的最终调节因子［15］。OPG主要由成骨细胞前体和间质细胞产生，是目前已知惟一一个与定位于成骨细胞膜上的RANKL结合的饵受体，RANKL一旦与RANK结合就会刺激前体破骨细胞分化，活化成熟的破骨细胞，引起骨吸收。而OPG可与膜受体RANK竞争性结合RANKL，从而封闭成骨细胞诱导的破骨细胞前体分化、存活与融合，抑制成熟破骨细胞活化，诱导破骨细胞的凋亡［16，17］。本研究发现，术后12周红曲组血清OPG含量高于模型组及假手术组，且BMD与OPG存在正的直线相关关系，推测红曲通过改变血清OPG含量来改善骨质疏松。

红曲是来源于祖国医学宝藏的中药他汀，既有综合降脂的作用，又有别于化学制剂的西药他汀，具有“天然”的特点，易被广大群众接受，药物剂量易于掌握和控制，且价格低廉，毒副作用小，无明显CK升高、肌病发生及肝、肾功能损害情况，并且消化道反应发生率较他汀类药物稍低，同时具备降压、降脂的作用，故患者的依从性高，安全性好［18］。黄宏南采用乙醇溶解、RP-HPLC法分离测定红曲中洛伐他汀较为完全［19］，杨成龙等利用超声波辅助法提高了红曲的提取率，超声提取是利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，增强介质的穿透力以提取中药有效成分的方法，而且超声波提取时不需要加热，避免了常规煎煮法对有效成分的破坏［20］。本实验采用乙醇溶解、超声波振荡、在水浴氮气条件下使用旋转蒸发器的方法可以充分溶解红曲粉末，能有效浓缩红曲醇提液，色泽深红。

降钙素是一种强的抗骨吸收的药物，每个破骨细胞存在降钙素受体100万个以上，存在对破骨细胞增殖和凋亡的调节作用［21］，同时降钙素能促进成骨细胞的增殖及成骨细胞中OPG mRNA的表达，同时抑制RANKL mRNA的表达［22］。本实验降钙素组较红曲组、模型组BMD下降减缓，OPG、ALP分别高于和低于红曲组、模型组，说明降钙素在促进骨形成、抑制骨吸收，降低骨代谢率方面优于红曲，但降钙素存在价格昂贵、副作用较多的缺点［23］。

总之，红曲具有预防、治疗绝经后骨质疏松症，延缓骨量减少，降低骨代谢的作用;推测红曲是通过改变血清OPG含量来实现改善骨质疏松的作用。同时红曲具有降脂、降压等作用，具有安全性高、毒副作用少等特点。随着研究的逐渐深入，红曲治疗骨质疏松的机制将进一步明确，天然他汀红曲将拥有广阔的市场前景。

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