氯丙嗪协同榄香烯对PLA801D细胞的增殖抑制作用

王力玄 周佳莹 马忠森 (吉林大学白求恩医学院2009级，吉林 长春 3002)张 侠 (南航吉林分公司航卫室)

肺癌近年来发病率呈上升趋势〔1〕，由于各种因素的影响，患者明确诊断时往往已达晚期，失去手术根治的机会，故化疗成为这类患者治疗的主要手段。但由于多药耐药(MDR)的存在常致使药物对肺癌的治疗失败，严重影响化疗的效果和预后。因此，本文应用盐酸氯丙嗪作为化疗药物榄香烯的增敏剂，观察其对PLA801D细胞的增殖抑制作用及细胞周期进程的变化，旨在为肺癌化疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 PLA801D细胞株购于北京解放军总医院;榄香烯乳注射液为大连金港制药有限公司生产，国家二类抗肿瘤药，RPMI1640培养基;MTT试剂购于美国Sigma公司，胎牛血清购自长春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 收集对数生长期的PLA801D细胞，调细胞数为2×105/ml接种96孔塑料培养板内，每孔100 ml，当细胞生长达到80%汇合时分为单纯榄香烯组20、40、80 μg/ml及空白对照组，每个浓度10复孔 静止培养24 h后，于培养结束前6 h加入MTT试剂，每孔内20 μl，MTT终浓度为500 mg/L。继续培养6 h后，每孔内分别加入二甲基亚砜溶液150 μl/孔。10 min后于酶标仪570 nm处测试各孔吸光度A值，根据下列公式计算PLA801D细胞增殖抑制率:PLA801D细胞抑制率=(1－加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100%

1.2.2 联合组用药方法 根据预实验结果，取40 μg/ml榄香烯组再加入4 mg/ml氯丙嗪为联合组。

1.2.3 流式细胞术 细胞分组同1.2.2，不同之处是将96孔塑料培养板改为25 μl培养瓶进行培养，培养结束后收集不同浓度榄香烯作用的PLA801D细胞，离心弃上清，加入70%冷乙醇固定4℃内保存，上机前过40目尼龙网，调细胞数为1×106/ml，PI染色流式细胞仪分析，结果以Modifi 2.0软件分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS11.0软件，细胞周期分析采用F检验，细胞增殖抑制率分析采用t检验。

2 结果

2.1 PLA801D细胞增殖抑制率 MTT结果显示单纯榄香烯组20、40、80 μg/ml组随着榄香烯浓度的增加细胞抑制率增高。三组间两两比较，差异均有统计学意义;但是联合组(40 μg/ml榄香烯联合4 mg/ml氯丙嗪)效果最佳，细胞抑制率超过单纯80 μg/ml榄香烯组。见表1。

表1 不同浓度榄香烯对PLA801D细胞的增殖抑制率(，%)

表1 不同浓度榄香烯对PLA801D细胞的增殖抑制率(，%)

组别 A值 抑制率(%) P值1.39±0.11 － －20 μg/ml组 1.12±0.18 19.5 ﹤0.01 40 μg/ml组 0.93±0.15 33.1 ﹤0.01 80 μg/ml组 0.84±0.21 39.6 ﹤0.01联合组 0.71±0.22 49.2 ﹤0.01对照组

2.2 流式细胞术检测结果 单纯榄香烯组随着药物浓度增加细胞周期进程变化明显，尤其是联合组变化显著，证明氯丙嗪可促进榄香烯的药代动力学作用，具有较强的增敏效应。见表2。

表2 不同组别对PLA801D细胞周期进程的影响(，%)

表2 不同组别对PLA801D细胞周期进程的影响(，%)

59.4±2.4 35.9±1.3 4.6±1.7 0.5 20 μg/ml组 52.3 ±3.1 43.9 ±1.7 9.6 ±0.8 6.2 40 μg/ml组 40.2 ±2.6 39.9 ±1.8 16.6 ±1.4 9.7 80 μg/ml组 35.3 ±2.1 46.6 ±1.6 18.1 ±2.3 13.0联合组凋亡率对照组组别 G0/G1 S G2/M 26.3±2.1 52.7±2.7 20.9±3.2 17.5

3 讨论

肺癌的耐药性一直是影响其化疗效果的一大难题。耐药性的产生机制非常复杂，随着现代分子生物学技术的发展，不断有新的观点提出〔2〕，尤其是化疗增敏剂的应用，为肺癌多药耐药拮抗治疗开辟了新途径。化疗增敏剂是指没有抗肿瘤作用，但能提高已知有抗肿瘤作用药物的化疗效果〔3〕，增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤或降低其对正常组织毒性的一类药物。氯丙嗪属于吩噻嗪类化合物，是一种钙调蛋白抑制剂，与化疗药物作用后显著改变化疗药物的药代动力学机制〔4〕，不仅能使药物达到有效浓度，而且可减少药物的毒副作用，叶欣等〔5〕报道盐酸氯丙嗪具有体外逆转肿瘤多药耐药作用，但其协同榄香烯抗肿瘤作用的报道甚少。

本研究应用MTT比色法检测不同浓度的榄香烯对PLA801D细胞增殖抑制均获得较为满意的结果，尤其是榄香烯联合氯丙嗪对PLA801D细胞的抑制率达高于榄香烯80 μg/ml组，说明氯丙嗪与榄香烯合用具有显著的协同作用。

本研究还应用流式细胞仪检测不同浓度的榄香烯对PLA801D细胞周期进程的影响。结果显示，G1/G0期细胞增多，S期细胞减少G2/M期细胞相对增多。G1/G0期细胞又称细胞复制前期，G1期是制造和产生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体。细胞周期中的G1→S期是细胞转录的交接点，已经确认为是细胞生长调控的关键调控点，它能阻止细胞过度或无限制生长。因此抑制细胞周期G1期的RNA及核蛋白体的合成，间接地使肿瘤细胞减少，尤其是联合组作用更为显著，抑制G1期向S期转化进程，从而使G2期细胞相对增多，而G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反映〔6〕。这一点从细胞凋亡率上可得到证实。

综上所述，榄香烯联合氯丙嗪对PLA801D细胞增殖抑制有较强的协同作用，但其协同效应机制目前还不十分清楚，有待进一步深入研究。

1 潘晋坤，李宝平，张 雷，等.奥曲肽联合顺铂和5-氟尿嘧啶对人肺腺细胞株 A549抑制的增效作用〔J〕.国际肿瘤学杂志，2012;39(6):469-72.

2 Shen LZ，Hua YB，Yu XM，et al.Tamoxifen can reverse multidrug resistance of colorectal carcinoma in vivo〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(7):1060-4.

3 张志红，宋朝晖，倪秉强，等.肿瘤化疗增敏剂研究进展〔J〕.国际肿瘤学杂志，2006;33(7):506-7.

4 Okumieff P，Meyn RE，Teicher B，et al.Report from the radiation oncology committee of the Southwest Oncology Group(SWOG):Research objectives workshop ，2003〔J〕.Am J Clin Oncol，2003;26(5):522-5.

5 叶 欣，沈绍华陈立军，等氯丙嗪对耐药细胞系 K562/A0Z多药耐药逆转作用的研究〔J〕.肿瘤防治杂志，2004;11(10):1304-5.

6 Shao J，Lee SB，Guo H，et al.Prostagland in E2 stimulates the growth of coloncancer cells via induction of amphire gulin〔J〕.Cancer Res，2003;63(17):5218-20.