氯丙嗪在不同种属肝微粒体中代谢差异研究

董 凡，谭 叙，何 欣，谢 晴，谭 峰

(1.大连理工大学环境学院，工业生态与环境工程教育部重点实验室，辽宁 大连 116024；2.大连海关综合技术服务中心，辽宁 大连 116001)

氯丙嗪(CPZ)又名冬眠灵，是一种吩噻嗪类药物[1]，具有安神、镇定的功效，常用来治疗精神类疾病[2]，其在兽医临床上应用广泛，一方面可以降低动物的死亡率，另一方面可以间接起到增加动物体质量的作用[3]。氯丙嗪的过量使用容易引起白细胞减少和迟发性运动障碍等，危害生物健康[2]。氯丙嗪容易在生物体内代谢，采用体外孵育肝微粒体的方法进行代谢研究，既可模拟药物在体内的代谢过程[4]，又可避免体内复杂基质对结果产生影响[5]，因此，研究肝微粒体体外孵育氯丙嗪的代谢对于指导临床用药具有重要意义。

氯丙嗪代谢产物种类多、含量低，对其分析检测存在困难，常用的检测方法有毛细管电泳安培法[6]、分光光度法[7]、高效液相色谱法[8]、液相色谱-质谱联用法[9-10]、酶联免疫法[11-12]等，其中，液相色谱-质谱法具有检出限低、选择性强等优点[13]，已成为目前检测氯丙嗪及其代谢产物的重要方法。

鼠是研究药物代谢的常用动物；猪和鸡作为代表性家畜，是人们肉类摄取的主要来源。本研究拟选用鼠、猪、鸡3种肝微粒体体外孵育氯丙嗪，计算氯丙嗪体外代谢半衰期和固有清除率，使用液相色谱-质谱法推断氯丙嗪可能的代谢产物，比较氯丙嗪在不同种属之间的代谢速率和代谢途径差异，为药代动力学研究提供依据[14]。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Agilent RPLC/6410B液相色谱-三重四极杆串联质谱：美国安捷伦科技有限公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)；VM-02U型涡旋仪、小型水浴锅：美国Crystal公司产品；BSA224S型电子天平：德国Sartorius公司产品；Smart-S15实验室纯水系统：上海和泰公司产品；离心机：上海安亭仪器厂产品。

1.2 主要试剂与材料

三羟甲基氨基甲烷：北京Solarbio公司产品；乙腈：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品；甲酸：色谱纯，天津市科密欧公司产品；鼠、猪、鸡肝微粒体：武汉普莱特生物医药有限公司产品；还原辅酶Ⅱ四钠盐、盐酸氯丙嗪：阿拉丁试剂有限公司产品。

1.3 溶液配制

盐酸氯丙嗪储备液的配制：称取100.0 mg盐酸氯丙嗪，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到终浓度为10 g/L的储备液，于-20 ℃避光保存。

Tris-HCl缓冲溶液的配制：称取0.61 g Tris，用超纯水溶解，HCl调至pH 7.4，最后定容至100 mL，得到终浓度为0.05 mol/L的储备液。

NADPH溶液的配制：称取0.084 4 g NADPH，用超纯水溶解并定容至10 mL，得到终浓度为10 mmol/L的储备液，于4 ℃避光保存。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 Waters C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)；柱温40 ℃；进样体积10 μL；流速0.25 mL/min；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为乙腈溶液；氯丙嗪在不同种属肝微粒体孵育体系中代谢速率的梯度洗脱条件：0～8 min(65%B)，8～15 min(20%B)；氯丙嗪在不同种属肝微粒体孵育体系中代谢产物的梯度洗脱条件：1～15 min(5%B)，15～17 min(5%～90%B)，17～17.1 min(90%～5%B)，17.1～21 min(5%B)。

1.4.2质谱条件 电喷雾正离子采集模式；雾化气压力0.31 MPa；干燥气温度250 ℃；干燥气流速14 L/min；鞘气温度350 ℃；鞘气流速8 L/min；使用选择离子扫描模式(SIM)研究氯丙嗪在不同种属肝微粒体孵育体系中的代谢速率；使用全扫描模式(full scan)研究氯丙嗪在不同种属肝微粒体孵育体系中的代谢产物。

1.5 实验方法

分别用鼠、猪、鸡3种肝微粒体对氯丙嗪进行体外孵育，孵育体系总体积为0.5 mL，含有0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液、0.5 g/L肝微粒体、10 mg/L氯丙嗪。孵育体系在37 ℃水浴孵育5 min后，加入50 μL 10 mmol/L的NADPH溶液启动反应，设置0、20、60、120 min不同的反应时间，反应时间到达后，立即加入0.5 mL的4 ℃乙腈终止反应，以8 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.22 μm微孔纤维素滤膜后，进行检测分析。设置空白对照组，即不添加氯丙嗪，反应时间为120 min。

1.6 数据分析及相关计算公式

实验采用液相色谱-质谱联用法测定氯丙嗪的峰面积，将氯丙嗪在肝微粒体中反应0 min的峰面积A0作为100%，反应20、60、120 min的峰面积At与A0相比，得到氯丙嗪的剩余百分比；用剩余百分比的自然对数与时间做线性关系图，得到斜率k；利用公式T1/2=0.693/(-k)，计算得到氯丙嗪在不同种属肝微粒体中的半衰期T1/2；再根据公式CLint=[0.693/(T1/2)×孵育体系体积(mL)]/肝微粒体质量(mg)，计算得到氯丙嗪在不同种属肝微粒体中的固有清除率(CLint)。

2 结果与讨论

2.1 氯丙嗪在不同种属肝微粒体中的代谢速率

氯丙嗪在鼠、猪、鸡肝微粒体中的剩余百分比-时间关系曲线示于图1。可以看出，氯丙嗪在不同种属的肝微粒体孵育体系中的代谢速率差异较大。在猪肝微粒体孵育体系中代谢最快，反应120 min后，氯丙嗪仅剩余2.34%，接近代谢完全，而在鼠、鸡肝微粒体孵育体系中代谢较慢，反应120 min后，氯丙嗪剩余百分比分别为59.94%和77.76%。氯丙嗪在鼠、猪、鸡肝微粒体孵育体系中剩余百分比的自然对数(y)与时间(x)的线性回归方程分别为y=-0.004x+4.601(R2=0.99)，y=-0.038x+4.343(R2=0.99)，y=-0.002x+4.565(R2=0.89)，计算得到体外代谢半衰期T1/2分别为173.3、18.2、346.5 min，CLint分别为8.0、76.2、4.0 μL/(min·mg)。

2.2 氯丙嗪在不同种属肝微粒体孵育体系中体外代谢产物的结构鉴定

氯丙嗪在肝微粒孵育体系中孵育120 min后，与空白体系的谱图对比，共发现了8种代谢产物(M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8)，氯丙嗪(M0)及8种代谢产物的信息列于表1，提取离子流图示于图2。根据氯丙嗪的结构、代谢产物的信息，推断代谢产物的结构和氯丙嗪的代谢途径。

图2 鼠(a)、猪(b)、鸡(c)肝微粒体孵育体系中氯丙嗪及其代谢产物的提取离子流图Fig.2 Extraction ion chromatograms of chlorpromazine and its metabolites in the liver microsome incubation systems of rat (a),pig (b) and chicken (c)

母体化合物氯丙嗪M0的保留时间为12.640 min，准分子离子峰[M+H]+为m/z319，经碰撞裂解后，产生m/z274、246、214、86碎片离子。其中m/z274碎片离子是由氯丙嗪失去—HN(CH3)2形成的；m/z246碎片离子是由m/z274失去—CH2CH2形成；m/z214碎片离子比m/z246少32 u，由此推断是失去—S形成的。氯丙嗪可能的碎裂结果示于图3。

图3 氯丙嗪可能的碎裂途径Fig.3 Possible fragmentation pathways of chlorpromazine

氯丙嗪在体内的代谢主要分为氧化、羟基化和去甲基化3种途径。代谢产物M1、M4、M8的准分子离子峰[M+H]+均为m/z335，比氯丙嗪多16 u，推测是氯丙嗪羟基化或氧化产物。由氯丙嗪化学结构可知，其容易在6β-、7β-位发生羟基化反应，在硫原子位置发生氧化反应。M4产生了m/z230的特征碎片离子，比氯丙嗪的m/z214碎片离子多16 u，表明苯环上发生了羟基化反应，因此推测M4是羟基化产物；对于产物M1和M8，仅凭二级质谱图无法确定是羟基化或氧化产物，因此推测M1、M4、M8可能是6-羟基氯丙嗪、7-羟基氯丙嗪、氯丙嗪亚砜。

代谢产物M2、M5的准分子离子峰[M+H]+均为m/z351，比氯丙嗪多32 u，产生的m/z262碎片离子比氯丙嗪的m/z246碎片离子多16 u，表明发生了羟基化或者氧化反应，但根据二级质谱图无法确定M2和M5是羟基化产物或氧化产物，因此M2和M5有6-羟基氯丙嗪亚砜、7-羟基氯丙嗪亚砜或6,7-二羟基氯丙嗪3种可能结构。

代谢产物M7的准分子离子峰[M+H]+为m/z305，比氯丙嗪少14 u，推测是氯丙嗪失去1个亚甲基产生的。M7和氯丙嗪都含有m/z274、246碎片离子，而M7产生的m/z72碎片离子比氯丙嗪的m/z86碎片离子少14 u，表明是氯丙嗪侧链失去1个亚甲基产生的，因此推测M7是去甲基氯丙嗪。

代谢产物M3的准分子离子峰[M+H]+为m/z321，比M7多16 u，产生了与M7相同的m/z72特征碎片离子，并且根据m/z230碎片离子，推测苯环上6β-、7β-位发生羟基化反应，因此推测M3是7-羟基去甲基氯丙嗪或6-羟基去甲基氯丙嗪。

代谢产物M6的准分子离子峰[M+H]+为m/z291，比M7少14 u，同样产生与M7相同的m/z274、246碎片离子，表明M6是M7侧链失去1个亚甲基产生的，因此推测M6是去二甲基氯丙嗪。

氯丙嗪在鼠、猪、鸡肝微粒体孵育体系中分别产生5、7和4种代谢产物，由于不同物种体内代谢酶的差异，代谢途径有所不同，结果分别示于图4、5、6。在3种肝微粒体孵育体系中，氯丙嗪在鸡肝微粒体中的代谢途径最简单，在猪肝微粒体中最复杂。在鸡肝微粒体中，氯丙嗪发生了3种不同类型的反应，分别是氧化反应生成氯丙嗪亚砜、去甲基反应生成去甲基氯丙嗪、羟基化反应生成6-羟基氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪，这些反应在猪和鼠肝微粒体中均有发生。除此之外，在鼠肝微粒体中，去甲基氯丙嗪发生了去甲基反应生成了去二甲基氯丙嗪，在猪肝微粒体中生成了2个m/z351的代谢产物，由于凭借二级质谱不能确定是羟基化或氧化产物，所以推测这2个产物为6-羟基氯丙嗪亚砜、7-羟基氯丙嗪亚砜或6，7-二羟基氯丙嗪。

图4 氯丙嗪在鼠肝微粒体孵育系统中可能的代谢途径Fig.4 Possible metabolic pathways of chlorpromazine in the rat liver microsome incubation systems

在不同种属肝微粒体孵育体系中，氯丙嗪的代谢产物不仅种类不同，而且含量存在差异，对每个代谢物的提取离子流图进行积分，结果示于图7。根据剩余氯丙嗪的峰面积可以看出，氯丙嗪在猪肝微粒体孵育体系中的剩余量远远低于鼠、鸡，表明猪孵育体系代谢能力最好。氯丙嗪在鼠和鸡肝微粒体中的主要代谢产物相同，以M1、M4、M7为主，而在猪肝微粒体孵育体系中，主要代谢产物为M3、M5、M8。综上所述，氯丙嗪在鼠和鸡肝微粒体中代谢相似，以羟基化和去甲基化为主，而在猪肝微粒体中以氧化和羟基化为主。

图5 氯丙嗪在猪肝微粒体孵育系统中可能的代谢途径Fig.5 Possible metabolic pathways of chlorpromazine in the pig liver microsome incubation systems

图6 氯丙嗪在鸡肝微粒体孵育系统中可能的代谢途径Fig.6 Possible metabolic pathways of chlorpromazine in the chicken liver microsome incubation systems

图7 在鼠、猪、鸡肝微粒体孵育体系中，氯丙嗪及其代谢产物的峰面积Fig.7 Peak areas of chlorpromazine and its metabolites in the rat,pig and chicken liver microsome incubation systems

3 结论

本研究利用液相色谱-质谱联用法测定氯丙嗪在鼠、猪、鸡肝微粒体孵育体系中的代谢速率和代谢产物。结果表明，氯丙嗪在猪肝微粒体孵育体系中代谢最快，其次是鼠、鸡。在3种肝微粒体孵育体系中共发现8种代谢产物，在鼠、猪和鸡肝微粒体孵育体系中分别发现5、7和4种氯丙嗪代谢产物，其中3种肝微粒体孵育体系中均检测出产物氯丙嗪亚砜、去甲基氯丙嗪、6-羟基氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪。虽然不同种属之间代谢产物的种类和含量存在差异，但氯丙嗪在3种肝微粒体孵育体系中都存在氧化反应、羟基化反应、去甲基反应，其中检测到的6-羟基氯丙嗪、6-羟基氯丙嗪亚砜、7-羟基氯丙嗪亚砜和6，7-二羟基氯丙嗪尚未见文献报道。