酪氨酸酚裂解酶及其在L－酪氨酸酶法合成中的应用

韦平和，彭加平，营 佳

(常州工程职业技术学院 江苏省应用酶工程技术研究开发中心，江苏 常州 213164)

酪氨酸酚裂解酶及其在L－酪氨酸酶法合成中的应用

韦平和，彭加平，营 佳

(常州工程职业技术学院 江苏省应用酶工程技术研究开发中心，江苏 常州 213164)

L－酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，应用酶法取代水解法生产L－酪氨酸是近年来氨基酸工业的研究热点之一。本文对酪氨酸酚裂解酶的结构、机制及应用进行了综述，为酶法生产L－酪氨酸及其衍生物提供参考。

酪氨酸酚裂解酶;L－酪氨酸;合成;结构;机制

酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol－lyase，TPL，EC 4.1.99.2)，也称β－酪氨酸酶，在生物体内催化L－酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L－酪氨酸［1］，而L－酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，以及L－多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。该酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体中，其中酶活较高的微生物主要是草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、中间柠檬酸菌(Citrobacter intermedius)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)以及嗜热菌Symbiobacterium thermophilum和Symbiobacterium toebii等［2］。近年来，来源于上述微生物的 TPL，其空间结构和作用机制已得到较深入研究，并在工业化应用方面取得重要进展。

1 TPL的结构特征

1.1 氨基酸组成

C.freundii MT－10419 TPL 的结构基因长 1 368 bp，编码由456个氨基酸残基组成的蛋白质，与辅酶结合的氨基酸残基是Lys257。E.intermedia FKU10N 和 E.herbicola AJ 2982 TPL同样由456个氨基酸残基组成，亚基相对分子质量(Mr)分别为51 441和51 364，氨基酸序列同源性为90.6%。Lee等［3］报道，S.thermophilum 和 Symbiobacterium SP.SC－1 TPL由458个氨基酸残基组成，结构基因长1 374 bp，与辅酶结合的氨基酸残基为Lys258，亚基Mr分别为52 269和52 196，氨基酸序列同源性为99.3%。

1.2 辅酶和单价阳离子结合位点

TPL由4个相同的亚基组成。Demidkina等［4］将每个亚基分成N－末端臂、小结构域、大结构域及结构域间的连接区等四个部分。TPL的催化活性需要磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)作为辅因子。每个亚基含有1个PLP结合位点，该位点位于一个亚基大、小结构域与结晶学相关的另一亚基大结构域之间形成的深裂内。TPL的催化活性还需要单价阳离子K+或NH4+作为激活剂。每个亚基含有1个K+结合位点，该位点位于结晶学相关的二个亚基之间相联系的界面上，具有稳定催化二聚体的作用。K+的配位数为7，它们是一个亚基Gly52和Asn262的羧基氧、另一个结晶学相关亚基Glu69的主链羧基氧与侧链羧基氧，以及三分子水。Phillips等［5］认为，Lys256 紧邻 PLP 结合位点 Lys257，在单价阳离子结合位点的形成中具有关键作用。不同阳离子与配位体在距离上的微小差异，引起了活性部位构象的细微改变，这可能是不同阳离子对TPL活性具有不同效应的原因。

1.3 不同pH条件下的构象变化

TPL催化L－酪氨酸裂解的最适 pH为8.2，pH 6.0时该酶基本没有活性。一般认为这种高、低pH情况下的酶活差异是由于p K a约为7.8的二种催化碱的质子化引起的。Milic等［6］将晶体分别生长于 pH 6.0 和8.0 所得的 C.freundii脱辅基TPL结构比较研究表明，pH 6.0时酶活的显著降低可能是由于活性部位氨基酸残基Tyr71、Arg381和Tyr291以及单价阳离子结合残基Glu69的构象变化引起的。pH 6.0时脱辅基TPL活性部位呈开放构象，pH 8.0时却存在开放和闭合二种构象。相对于开放构象，闭合构象中的小结构域刚性区域呈16°旋转向大结构域移动12Å，致使小刚性区域 Phe36、Met391、Arg381、Arg404、Phe448 和 Phe449 的位置和构象发生变化，从而关闭了活性部位裂。

2 TPL的作用机理

TPL催化的β－消除反应机制主要包括以下步骤:酶活性部位Lys257的ε－氨基与PLP共价结合形成内醛亚胺，内醛亚胺与底物L－酪氨酸作用形成外醛亚胺，Lys257夺取外醛亚胺(底物)Cα质子产生醌型中间物，经底物Cγ质子化及Cβ－Cγ键断裂生成α－氨基丙烯酸中间物，α－氨基丙烯酸中间物进一步受与PLP结合的Lys257ε－氨基攻击再生TPL全酶［7］。

醌型中间物和Cβ－Cγ键断裂是TPL催化β－消除反应的中心和关键。醌型中间物相当不稳定，难以观察其结构及反应过程中的构象变化。Phillips等［8］用快速扫描停流分光光度法(rapid－scanning stopped－flow spectrophotometric method)，在C.freundii TPL催化以 S－乙基－L－半胱氨酸为底物的反应中，添加能选择性结合并稳定醌型中间物的苯酚类似物4－羟基吡啶(5 mmol/L)，首次发现在338 nm处呈指示醌型中间物的新吸收峰。Milic等［9］对 C.freundii TPL催化以 L－甲硫氨酸为底物所形成的醌型中间物结构及机制研究表明，TPL活性部位的部分闭合可能发生于外醛亚胺形成时期，而完全闭合发生于醌型中间物形成期间或随后。活性部位的闭合可保护醌型中间物免于溶剂影响，而且能将具有重要催化作用的Arg381和Thr124移至合适位置，以便与醌型中间物和过渡态相互作用，进而有利于酮－醌型中间物的形成以及随后的苯酚消除。

随后，Milic等［10］对捕捉到的 Cβ－Cγ键断裂前后中间物结晶快相(crystallographic snapshots)研究时发现，活性部位处于开放构象时醌型中间物呈松弛态(relaxed)，活性部位闭合时醌型中间物被诱导而呈应变态(strained)，应变态结构主要依靠底物的酚羟基与Arg381、Thr124之间形成的氢键来维持稳定。为了释放这种紧张，应变态醌型中间物更易于Cγ质子化和Cβ－Cγ键的断裂。Milic等推测，TPL催化的β－消除反应后阶段步骤，即酮－醌型中间物的形成及随后的苯酚消除，不仅发生于闭合的活性部位内，而且醌型中间物受活性部位闭合的诱导发生应变而有利于反应的进行。而且，在Cβ－Cγ键断裂之后，活性部位又呈开放构象，以便产物的释放及与新的底物分子结合。因此，活性部位的闭合对于TPL发挥其催化活性具有关键作用。

3 TPL在L-酪氨酸酶法合成中的应用

TPL可用于生产L－多巴、L－酪氨酸及其衍生物。日本味之素(Ajinomoto)公司于1993年首先采用TPL生产L－多巴，其工艺是以E.herbicola TPL催化邻苯二酚、丙酮酸和氨合成L－多巴，可积累 L－多巴110 g/L，并生产出将近世界年产量(250 吨)一半的 L－多巴［11］。但是，这一工艺需在E.herbicola的培养基中添加L－酪氨酸以诱导表达TPL，而L－酪氨酸和L－多巴理化性质相近，从而造成分离纯化困难和生产成本增加［12］。相关的重要进展是 Koyanagi等［13］应用 DNA改组技术筛选出携带突变型调节基因 TyrR的E.herbicola，其TPL在无L－酪氨酸诱导时可积累L－多巴11.1 g/(L·h)，而野生型TPL在有L－酪氨酸诱导时仅为0.375 g/(L·h)，生产率提高了30倍。用TPL生产L－多巴已实现工业化20年，而用TPL合成L－酪氨酸尚处于研发中。

3.1 用TPL合成L－酪氨酸的工艺路线

L－酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产L－酪氨酸具有重要的应用价值。用TPL合成L－酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的C.intermiedius固定化细胞作为催化剂，分批添加底物，建立75 mmol/L丙酮酸钠、45 mmol/L硫酸铵、45 mmol/L氯化铵和55 mmol/L苯酚的转化体系，反应5 h后可积累L－酪氨酸10 g/L。若将反应体系置于连续的柱反应器内，苯酚对L－酪氨酸的转化率达90%，且稳定性可维持5 d。其次是L－丝氨酸路线。由于L－丝氨酸可通过丝氨酸羟甲基转移酶(EC 2.1.2.1)催化甘氨酸和甲醛廉价制备，Lee等用产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)和E.herbicola ATCC 21434分别作为丝氨酸羟甲基转移酶和TPL的酶源，将以甘氨酸为底物合成L－丝氨酸的反应和以L－丝氨酸为底物合成L－酪氨酸的反应相偶联，反应体系含甘氨酸0.25 mol/L、PLP 0.5 mmol/L、四氢叶酸0.7 mmol/L、初始苯酚浓度0.32%，以37%甲醛启动反应16 h后，可产生L－酪氨酸26.3 g/L，甘氨酸转化率为61.4%，但该工艺存在甘氨酸对TPL抑制较强和操作复杂的明显不足。丙酮酸和L－丝氨酸对TPL均具有较高的Km值，需在反应体系中过量加入，不仅导致产率降低，而且引起产物分离困难。S－邻硝基苯－L－半胱氨酸(SOPC)是TPL适宜的人工底物，其Vmax比生理底物L－酪氨酸高三倍，而Km仅为L－酪氨酸的50%。Phillips等以C.freundii ATCC 29063细胞悬液作为酶源，4 mmol/L SOPC和4 mmol/L苯酚反应2 h，苯酚的转化率就达到70%，而且这一反应的最适pH较为宽泛(6.8～9.0)。不过，SOPC价格较高，从而限制了该工艺的工业化应用［14］。

3.2 用DNA改组技术提高TPL稳定性

上述丙酮酸、L－丝氨酸和SOPC三条工艺，均需添加另一底物苯酚，而苯酚能裂解细胞壁并使蛋白质变性，故在转化反应中一般采用固定化细胞形式和间歇添加方式来维持最低的苯酚浓度，以避免苯酚对TPL的抑制和失活作用。TPL存在于多种微生物体内，C.freundii等中温菌TPL对苯酚的耐受性较差，而嗜热菌TPL即使在高浓度苯酚条件下仍保持良好的稳定性，因此近年来嗜热菌TPL受到了人们的关注并对其稳定性进行了进一步研究。Kim等［15］以S.toebii TPL为对象，应用DNA改组技术从2万个突变型TPL中筛选得到突变型A13V，这种TPL在76℃时仍保留60%催化活性，而野生型TPL下降到20%以下;在3 mol/L尿素情况下能显示50%催化活性，而野生型TPL几乎完全失去活性。Rha等［16］也对S.toebii TPL进行了随机突变和重新装配并筛选得到7个突变型TPL，其催化活性平均增加了3倍，半失活温度提高了11.2℃。Kim等［17］应用具热稳定和化学稳定的S.toebii TPL粗提液为催化剂，设计了一个用于L－酪氨酸合成的流加式反应器系统，该系统由1个2.5 L的反应器和2个各0.5 L的底物贮罐组成，其中一个贮罐含2.2 mol/L苯酚和2.4 mol/L丙酮酸钠，另一个贮罐含0.4 mmol/L PLP和4 mol/L氯化铵(pH 8.5)，二贮罐内的底物溶液通过蠕动泵连续地流加到反应器中，并在反应器的液面上空间充满氮气以降低底物的氧化作用，经40℃反应30 h可积累L－酪氨酸130 g/L，苯酚的转化率最高可达94%。

3.3 用TPL合成L－酪氨酸衍生物

氮杂酪氨酸(aza－L－tyrosine)具有重要的潜在药用价值，2－氮杂酪氨酸最初是从Streptomyces sp.中分离出的具抗肿瘤活性的天然产物，3－氮杂酪氨酸也是从毒蘑菇Clitocybe acromelalga中分离出的天然产物。Watkins等［18］用来源于C.freundii的重组 TPL为催化剂，建立100 mmol/L氯化铵、0.162 mmol/L PLP、63 mmol/L 丙酮酸和 20 mmol/L 2－羟基吡啶的350 mL 反应体系，pH 8.0 ～ 8.2、25 ℃反应 5 d，可得纯化的2－氮杂酪氨酸45.3 mg;若用3－羟基吡啶代替2－羟基吡啶，pH 8.8 ～ 9.0、37 ℃反应 5 d，可得纯化的 3－氮杂酪氨酸36.5 mg。Seisser等［19］为缩短 3－取代酪氨酸衍生物繁琐的多步化学合成工艺，应用定点突变拓宽C.freundii TPL这种C－C键形成酶的底物特异性，以获得的突变型M379V TPL催化丙酮酸、氨和酚类化合物(邻甲苯酚、邻甲氧基苯酚和邻氯苯酚)合成相应的3－甲基、3－甲氧基和3－氯酪氨酸等L－酪氨酸衍生物，不仅只需一步反应，而且反应完全、无副产物，对映体量大于97%。

4 展望

微生物酶法合成氨基酸，以其反应周期短、选择性强、转化率高、分离纯化容易、所得产物均为L－型以及与环境友好等优点而日益受到重视，但天然的酶往往存在酶活不高、稳定性不够等缺陷，一定程度上限制了酶法工艺的推广应用。随着对TPL结构和功能研究的不断深入，应用定点突变、DNA改组等蛋白质工程技术对其进行结构改造，获得更高的催化活性和稳定性，将进一步推动该酶在酶法生产L－酪氨酸及其衍生物中的工业化应用。

［1］Koulikova V V，Zakomirdina L N，Gogoleva O I，et al.Stereospecificity of isotopic exchange of C－a－protons of glycine catalyzed by three PLP－dependent lyases:the unusual case of tyrosine phenollyase［J］.Amino Acids，2011，41(5):1247－1256.

［2］Chandel M，Azmi W.Optimization of process parameters for the production of tyrosine phenol lyase by Citrobacter freundii MTCC 2424［J］.Bioresour Technol，2009，100(5):1840－1846.

［3］Lee SG，Hong SP，Choi Y H，et al.Thermostable tyrosine phenollyase of Symbiobacterium sp.SC－1:gene cloning，sequence determination，and overproduction in Escherichia coli［J］.Protein Expr purif，1997，11(3):263－270.

［4］Demidkina T V，Antson A A，Faleev N G，et al.Spatial structure and the mechanism of tyrosine phenol－lyase and tryptophan indolelyase［J］.Mol Biol(Mosk)，2009，43(2):269－283.

［5］Phillips R S，Chen H Y，Shim D，et al.Role of lysine－256 in Citrobacter freundii tyrosine phenol－lyase in monovalent cation activation［J］.Biochemistry，2004，43(45):14412－14419.

［6］Milic D，Matkovic－Calogovic D，Demidkina T V，et al.Structures of apo and holo tyrosine phenol－lyase reveal a catalytically critical closed conformation and suggest a mechanism for activation by K+ions［J］.Biochemistry，2006，45(24):7544－7552.

［7］Phillips R S，Demidkina T V，Faleev N G.Structure and mechanism of tryptophan indole－lyase and tyrosine phenol－lyase［J］.Biochim Biophy Acta，2003，1647(1－2):167－172.

［8］Phillips R S，Chen H Y，Faleev N G.Aminoacrylate intermediates in the reaction of Citrobacter freundii tyrosine phenol－lyase［J］.Biochemistry，2006，45(31):9575－9583.

［9］Milic D，Demidkina T V，Faleev N G，et al.Insights into the catalytic mechanism of tyrosine phenol－lyase from X－ray structures of quinonoid intermediates［J］.J Biol Chem，2008，283(43):29206－29214.

［10］ Milic D，Demidkina T V，Faleev N G，et al.Crystallographic snapshots of tyrosine phenol－lyase show that substrate strain plays a role in C－C bond cleavage［J］.J Am Chem Soc，2011，133(41):16468－16476.

［11］ Ogawa J，Shimizu S.Industrial microbial enzymes:their discovery by screening and use in large－scale production of useful chemicals in Japan［J］.Current Opinion in Biotechnology，2002，13:367－375.

［12］ Koyanagi T，Katayama T，Suzuki H，et al.Effective production of 3，4－dihydroxyphenyl－L－alanine(L－DOPA)with Erwinia herbicola cells carrying a mutant transcriptional regulator TyrR［J］.J Biotechnol，2005，115(3):303－306.

［13］ Koyanagi T，Katayama T，Suzuki H，et al.Hyperproduction of 3，4－dihydroxyphenyl－L－alanine(L－DOPA)using Erwinia herbicola cells carrying a mutant transcriptional regulator TyrR［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(5):1221－1223.

［14］ Lutke－Eversloh T，Santos C N，Stephanopoulos G.Perspectives of biotechnological production of L－tyrosine and its applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，77(4):751－762.

［15］ Kim JH，Song J J，Kim B G，et al.Enhanced stability of tyrosine phenol－lyase from Symbiobacterium toebii by DNA shuffling［J］.J Microbiol Biotechnol，2004，14(1):153－157.

［16］ Rha E，Kim S，Choi S L，et al.Simultaneous improvement of catalytic activity and thermal stability of tyrosine phenol－lyase by directed evolution［J］.FEBSJ，2009，276(21):6187－6194.

［17］ Kim Y D，Rha E，Choi SL，et al.Development of bioreactor system for L－tyrosine synthesis using thermostable tyrosine phenol lyase［J］.J Microbiol Biotechnol，2007，17(1):116－122.

［18］ Watkins E B，Phillips R S.Enzymatic synthesis of Aza－L－tyrsines［J］.Bioorg Med Chem Lett，2001，11(16):2099－2100.

［19］ Seisser B，Zinkl R，Gruber K，et al.Cutting long syntheses short:access to non－natural tyrosine derivatives employing an engineered tyrosine phenol lyase［J］.Adv Synth Catal，2010，352(4):731－736.

Tyrosine phenol-lyase and its application in enzymatic synthesis of L-tyrosine

WEI Ping－he，PENG Jia－ping，Ying Jia
(Applied Enzyme Engineering Technology R＆D Center of Jiangsu，Changzhou Institute of Engineering Technology，Changzhou 213164，China)

TQ464.8

A

1005－1678(2012)05－0695－03

2012－04－06

常州市科技支撑计划(CE20115033);江苏省“六大人才高峰”资助项目

韦平和，男，博士，副教授，从事生物活性物质的酶法合成和发酵制备研究，Tel:0519－86332163，E－mail:phwei@email.czie.net。