近红外光谱分析技术用于发酵工艺研究进展

张 惠，刘爱华，臧恒昌，郭学平

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东福瑞达生物医药有限公司，山东 济南 250101;3.国家糖工程技术研究中心，山东 济南 250012)

近红外光谱分析技术用于发酵工艺研究进展

张 惠1，3，刘爱华2，臧恒昌1，3，郭学平2

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东福瑞达生物医药有限公司，山东 济南 250101;3.国家糖工程技术研究中心，山东 济南 250012)

近红外光谱分析技术是近年来兴起的分析技术，具有方便快速的特点，具有广阔的应用前景。本文综述了近红外光谱分析技术在菌种选育及发酵过程参数控制等方面的研究进展，并指出了各采样方式的优缺点。

近红外光谱;菌种选育;发酵参数测定

近红外光谱(near infrared spectroscopy，NIRS)是介于可见光和中红外之间的电磁辐射波谱，美国材料检测协会(ASTM)将近红外光谱定义为780～2 526 nm的光谱区域，主要反映有机分子中含氢基团(O-H，N-H，C-H)振动的基频与合频吸收，结合化学计量学可用于物质的定性和定量分析［1］。其方便、快速、高效、准确和成本低的特点与美国食品药品管理局(FDA)所提出的过程分析技术(process analytical technology，PAT)概念相符合，被广泛用于一系列生产过程的过程控制［2-3］。近年来用于发酵工艺的研究也日益增多，本文对其研究近况进行了综述。

1 菌种选育

从自然界获得的菌种，通过进一步的菌种选育，不仅可为发酵工业生产提供各种类型的突变株，提高发酵单位，还可以改进产品质量，除去多余的代谢产物和合成新品种。但菌种选育过程中常常得到大量菌种，常规筛选方法效率低、进展慢，而NIRS可用于对菌株进行定性判别和定量分析，从而成为一种高通量筛选菌株的有效方法。Decker等［4］利用NIRS对生长于奶酪基质上的Penicillium camemberti不同菌株进行判别，利用不同的光谱预处理方法结合判别式最小二乘回归法(DPLS)，最终选择温度和波长扩展多元散射校正(temperature-and wavelength-extended multiplicative scatter cor-rection，TW-MSC)作为最佳分类结果的预处理方法。此预处理方法可有效降低温度对于光谱的影响。同时Morita等［5］利用NIRS成功定性判别出基因修饰后的Saccharomyces cerevisiae的表型和基因型不同的菌株。

此外，建立菌株发酵产物的主要有效成分的定量分析模型也可用于筛选高产突变菌株。郭伟良等［6］将468株蛹虫草突变株在不同的摇瓶发酵条件下进行发酵，收集菌丝体粉末样品采集光谱，并建立光谱与有效成分含量间的相关模型，最终得到的模型具有很好的拟合度和预测性能。Morita等［5］建立了基因修饰后的Saccharomyces cerevisiae菌株发酵过程中消耗原料和产物生成量的定量模型，实验结果也表明NIRS可快速准确判断菌株的发酵能力，因此可开发成为高通量筛选菌株的有效工具。

2 发酵过程监测

过去使发酵过程达到高产低成本的重要工艺手段有培养基的改进和补料等生产条件的优化，近年来过程参数监测也成为提高发酵产率的有效方式，并得到越来越多的应用。NIRS用于发酵过程参数的监测始于20世纪90年代，发酵液中的主要参数如碳源、氮源、生物量、产物量等均属于NIRS可监测的指标范围。按照其采样方式可分为:off-line(离线)、at-line(近线)和 on-line(在线)［7］。

2.1 off-line

off-line是指样本被取出并稍后分析，通常在预处理步骤之后［7］。Petersen等［8］认为发酵过程中营养物质、生物量和产物浓度是高度相关的，为确保模型的建立是基于分析物特定的信息，因此使用了半合成样品，即在来自Streptomyces coelicolor发酵过程的发酵液中添加不同量的葡萄糖、铵盐，并在采集光谱前采用0.45μm的滤膜过滤除菌体，结果表明铵盐的预测误差是in-situ(原位)采样方式误差的一半。Finn等［9］同样采用过滤发酵液的方式对Saccharomyces cerevisiae发酵过程中乙醇含量进行预测，模型取得较好的预测结果，分析原因是经过滤后，消除了生物量颗粒带来的散射作用，因此提高了模型质量。

off-line采样的特点是样品经过预处理除去一些干扰，所建立模型预测误差低、精度高，可辅助用于发酵过程中的多参数测定。但此方法无法快速监测发酵过程参数变化，因此越来越多的研究致力于at-line和on-line的采样方式，以便更好地用于过程的在线监测与控制。

2.2 at-line

at-line也即快速off-line分析，分析者在反应器附近，取出样品后即快速分析，常常在几分钟内完成［7］。at-line的采样形式所建立的模型是进一步在线应用的基础，Arnold等［10］等确定了Escherichia coli生物量的吸收波段为2 050～2 350 nm。Finn等［9］采取at-line的形式对生物量和产物质量指标(蛋白质比例)进行预测，结果可给出近实时信息，用于确定发酵终点并控制终产物质量。Crowley等［11］用于更具挑战性的重组Pichia pastoris发酵过程。此过程包括两种碳源(甘油和甲醇)以不同的速率和频率添加，发酵基质复杂，建立过程中生物量、甘油、甲醇和产物的一系列模型。实验结果表明NIRS可扩展应用于高细胞密度并伴有明显黏度变化的生物过程中。

at-line采样方式所取样品无需预处理，相比较于off-line能更快检测出发酵过程中各参数。通常在几分钟内，提供发酵过程的状态，并且通过变量选择确定目的分析物的有效光谱区间［12］，优化采集条件，为进一步NIRS的在线应用提供参考。

2.3 on-line

on-line测量方式可实现复杂基质中的生物和化学变化的实时监测。一般根据采样方式不同细分成两类:ex-situ(非原位)和in-situ。ex-situ通常包括采用流通小池或管路，或直接将反射探头置于反应器的玻璃外壁上;in-situ是指利用类似pH电极的探头装置放置于发酵罐内［13］。

2.3.1 ex-situ ex-situ采样方式中探头并不直接和液体接触，降低了对探头的要求，是实现在线监测的一种方式。Cavinato等［14］将采样探头置于反应罐玻璃外壁上，利用短波近红外光谱(700～1 100 nm)成功用于在线监测发酵过程中乙醇含量的变化。厌氧发酵产生物气过程中，甘油的添加量在一定浓度范围内(5～7 g/L)能增加生物气产出。Holm-Nielsen等［15］利用外部循环管路采集样品光谱在线监测和反馈控制甘油水平，使发酵过程始终保持在最佳状态。Lomborg等［16］在线监测玉米饲料厌氧发酵产生物气的过程，采用流通小池采集样品光谱，预测发酵过程中挥发性脂肪酸的含量变化。实验结果证明NIRS是实现在线监测的有效方式，且模型预测精度可满足实际生产要求。

ex-situ中采样探头置于玻璃外侧的采样方式，发酵罐中剧烈搅拌和通气将产生很大影响，而外部循环管路中则存在采样均匀性的问题。

2.3.2 in-situ in-situ采样方式是指将分析装置插入发酵液中。对所用探头有很高要求，首先，探头外壳必须承受灭菌时的压力和温度;其次，探头采集的光谱受生物菌体粒径、搅拌速率、通气速率等影响;其三，一旦采集方式(透射或反射，光程长等)确定就不可改变［17］。

Arnold等［10］利用 in-situ方式对 Escherichia coli发酵过程中生物量的变化进行预测，并考察了探头选择0.5，1和2 mm的光程长时光谱效果，最终选择了0.5 mm光程长为最佳采样条件，且研究发现在线采样所得光谱在大于2 100 nm时多为噪声信息，因此选择波段1 600～1 800 nm建立模型取得较好效果。Licinia等［18］利用傅里叶变换近红外光谱仪(FT-NIR)在线用于Streptomyces clavuligerus发酵过程的多组分同时测定，监测发酵过程中活性药物成分、黏度、N源、C源的含量，所得结果准确度可满足实际工业规模的实时监测的需要。Navratil等［19］同样采取in-situ采样方式，并将NIRS结合电子鼻(electronic nose，EN)绘图用于监测Vibrio cholerae发酵过程。结果表明，所建立的生物量，葡萄糖和乙酸盐的近红外模型具有很低的预测误差，而后将NIRS数据和EN数据经过主成分分析处理后分别得到第一主成分组合绘制得到补料分批培养的轨迹曲线，可用于实际生产中预防杂菌污染、控制流加速率等。

除在线用于细菌培养过程中，in-situ方式用于哺乳动物细胞培养过程中关键参数的监测也被证实可行［20］。动物细胞培养过程中，尤其是葡萄糖，常以低浓度(1.0～3.5 g/L)存在，增加了建模困难。作者发现当增加建模样本数目时，相关系数相应增加，而主因子数和校正误差相应降低，选择合适的样本数建立的模型证明利用NIRS用于细胞培养关键参数的实时监测是可行的。

in-situ探头的采用，是NIRS用于发酵过程的实时监测的趋势。但是，由于发酵基质的复杂性，在大规模应用此技术之前，仍存在一些实际问题需要克服，如发酵过程中剧烈的条件、发酵基质粘稠易堵塞采样狭缝及气泡的散射作用等。因此，如何提高模型的稳健性、准确性仍是研究重点。

3 问题与展望

微生物发酵过程是一个复杂的生化反应过程，通常气、液、固三态并存，因此在线检测对于整个发酵过程中了解微生物的生长规律和优化生产过程尤为重要。而实际过程分析中，多使用离线化学分析，这些方法操作繁琐、费时、费力。自NIRS用于发酵过程监测，从实验室规模到工业规模发展迅速。它可用于所有类型的发酵过程，但发酵过程的复杂性，使得此技术的广泛应用仍存在许多问题，大多数研究还停留在实验室阶段，用于工业规模的研究仍不足;NIRS容易受到各因素影响，如样品温度、转速、通气等。

经过几十年的发展，NIRS逐渐成为一种成熟的快速分析技术，被用于药品、食品、农产品等各个领域中。纵观发展趋势，NIRS作为可靠和稳健的工具用于监测生物过程将具有很大发展前景。

［1］陆婉珍.现代近红外光谱分析技术［M］.北京:中国石化出版社，2006:1-2.

［2］Roggo Y，Chalus P，Maurer L，et al.A review of near infrared spectroscopy and chemometrics in pharmaceutical technologies［J］.J Pharm Biomed Anal，2007，44(3):683-700.

［3］Woodcock T，Downey G，O'Donnell C P.Better quality food and beverages:the role of near infrared spectroscopy［J］.J Near Infrared Spec，2008，16(1):1-29.

［4］Decker M，Nielsen P V，Martens H.Near-infrared spectra of Penicillium camemberti strains separated by extended multiplicative signal correction improved prediction of physical and chemical variations［J］.Appl Spectrosc，2005，59(1):56-68.

［5］Morita H，Hasunuma T，Vassileva M，et al.Near infrared spectroscopy as high-throughput technology for screening of xylose-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae strains［J］.Anal Chem，2011，83(11):4023-4029.

［6］郭伟良，张卓勇，逯家辉，等.近红外光谱法在蛹虫草诱变筛选及其发酵条件优化中应用［J］.光谱学与光谱分析，2010，30(8):2077-2082.

［7］Scarff M，Arnold SA，Harvey L M，et al.Near infrared spectroscopy for bioprocess monitoring and control:current status and future trends［J］.Crit Rev Biotechnol，2006，26(1):17-39.

［8］Petersen N，Odman P，Padrell A E，et al.In situ near infrared spectroscopy for analyte-specific monitoring of glucose and ammonium in Streptomycescoelicolor fermentations［J］.Biotechnol Prog，2010，26(1):263-271.

［9］Finn B，Harvey L M，McNeil B.Near-infrared spectroscopic monitoring of biomass，glucose，ethanol and protein content in a high cell density baker's yeast fed-batch bioprocess［J］.Yeast，2006，23(7):507-517.

［10］ Arnold SA，Gaensakoo R，Harvey L M，et al.Use of at-line and insitu near infrared spectroscopy to monitor biomass in an industrial fed-batch Escherichia coli process［J］.Biotechnol Bioeng，2002，80(4):405-413.

［11］ Crowleya J，Arnold SA，Wood N，et al.Monitoring a high cell density recombinant Pichia pastoris fed-batch bioprocess using transmission and reflectance near infrared spectroscopy［J］.Enzyme Microb Tech，2005，36(5-6):621-628.

［12］ Ferreira A P，Alves T P，Menezes J C.Monitoring complex media fermentations with near-infrared spectroscopy:comparison of different variable selection methods［J］.Biotechnol Bioeng，2005，91(4):474-481.

［13］ Landgrebe D，Haake C，Hopfner T，et al.On-line infrared spectroscopy for bioprocess monitoring［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，88(1):11-22.

［14］ Cavinato A G.，Mayes D M，Ge Z H，et al.Noninvasive method for monitoring ethanol in fermentation processes using fiber-optic nearinfrared spectroscopy［J］.Anal Chem，1990，62(18):1977-1982.

［15］ Holm-Nielsen J B，Lomborg C J，Oleskowicz-Popiel P，et al.Online near infrared monitoring of glycerol-boosted anaerobic digestion processes:evaluation of process analytical technologies［J］.Biotechnol Bioeng，2008，99(2):302-313.

［16］ Lomborg C J，Holm-Nielsen J B，Oleskowicz-Popiel P，et al.Near infrared and acoustic chemometrics monitoring of volatile fatty acids and dry matter during co-digestion of manure and maize silage［J］.Bioresour Technol，2009，100(5):1711-1719.

［17］ Cervera A E，Petersen N，Lantz A E，et al.Application of near-infrared spectroscopy for monitoring and control of cell culture and fermentation［J］.Biotechnol Prog，2009，25(6):1561-1581.

［18］ Rodrigues L O，Vieira L，Cardoso J P，et al.The use of NIR as a multi-parametric in situ monitoring technique in filamentous fermentation systems［J］.Talanta，2008，75(15):1356-1361.

［19］ Navratil M，Norberg A，Lembren L，et al.On-line multi-analyzer monitoring of biomass，glucose and acetate for growth rate control of a Vibrio cholerae fed-batch cultivation［J］.J Biotechnol，2005，115(1):67-79.

［20］ Arnold SA，Crowley J，Woods N，et al.In-situ near infrared spectroscopy to monitor key analytes in mammalian cell cultivation［J］.Biotechnol Bioeng，2003，84(1):13-19.

Research progress in fermentation process with near infrared spectroscopy

ZHANG Hui1，3，LIU Ai-hua2，ZANG Heng-chang1，3，GUO Xue-ping2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Shandong Freda Biopharmaceutical Co.，Ltd.，Jinan 250101，China;3.National Glycoengineering Research Center，Jinan 250012，China)

TQ920.6

A

1005-1678(2012)05-0689-03

2012-01-15

张 惠，女，硕士研究生，制药工程学专业;臧恒昌，通信作者，教授，硕士生导师，Tel:0531-88382088，E-mail:zanghcw@126.com。