盐效应分离纤溶活性化合物FGFC1

张 启，包 斌，2，倪 玲，陈丽娟，田晓清，葛 亮，吴文惠，2

(上海海洋大学 1.食品学院，2.海洋科学研究院，上海 201306)

从海洋微生物中发现的小分子生物活性物质有萜类、胺及酰胺类、吲哚生物碱类、乙酰配基类、卤酚类、大环内酯类、生物活性肽、环肽类及聚丙酸酯类，这些小分子物质的生物活性作用主要体现在抗肿瘤、抗微生物、抗炎、抗凝血、降血压、抗氧化、酶抑制活性等。目前从海洋稀有微生物长孢葡萄穗霉(Stachybotrys longispora)分离纤溶活性化合物的还鲜有报道，我们对本研究室在2008年报道的一株产纤溶活性化合物的菌株长孢葡萄穗霉FG216(Stachybotrys longispora 216)培养液中纤溶活性化合物FGFC1(fungi fibrinolytic compound 1)采用盐效应的分离效果进行了研究。

近年来，盐效应分离作为一种新型分离技术越来越受到人们的重视，自然界种类繁多的无机盐都具有一定程度的盐效应［1-4］。在充分考虑无机盐的离子价态、离子体积的基础上，同时分析盐效应与系统组分、组成、盐浓度等因素的关系一般能获得理想的分离效果［5］。

FGFC1属于吡喃并异吲哚酮类小分子化合物(结构分析将另文报道)，在从培养液萃取的过程中，改善萃取环境会提高FGFC1的提取效率，如利用盐效应来提高萃取分离效果，加入溶于水相但本身不被萃取也不与溶质发生化学作用的盐如氯化钠、氯化铵为盐析剂，由于水合作用，盐析剂吸引了一部分自由水分子，使水溶液中自由水分子的量减少，被萃取物在水中的浓度相应增加，有利于FGFC1萃取。

基于上述的盐效应理论和FGFC1的特性，本文探讨了氯化钠、氯化铵和氯化钙三种盐对FGFC1提取效果的的影响并测定了FGFC1的化学特性。

1 材料

长孢葡萄穗霉FG216(Stachybotrys longispora 216)分离自舟山群岛海域离岸100 m附近的上层海水，液体保藏于－80℃冰箱，该菌株为本实验室所拥有。

长孢葡萄穗霉FG216培养基为马铃薯蔗糖(Potato Sucrose Agar，PSA)斜面培养基［6］;种子培养基为不含有琼脂的GSB培养基(葡萄糖35 g，可溶性淀粉10 g，脱脂大豆粉20 g，细菌学蛋白胨5 g，牛肉膏蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，氯化钠2 g，磷酸氢二钾 0.5 g，硫酸镁 0.05 g，水1000 mL，pH 为5.8)。发酵培养基为改良察氏培养基［7］(蔗糖50 g，硝酸钠 3 g，磷酸氢二钾 0.1 g，硫酸镁 0.5 g，氯化钾 0.5 g，酵母提取物 1 g，氯化钴 0.002 5 g，硫酸亚铁0.015 g，氯化钙0.006 5 g，水1 000 mL，pH 为5.8)。

QHZ-98A全温震荡培养箱、LHS-250SC型恒温恒湿培养箱、CR21G高速冷冻离心机，日本Hitachi;岛津SCL－10Avp分析型高效液相色谱仪;岛津LC-10AD)半制备型高效液相色谱仪;UV1102紫外可见分光光度计;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(Voyager-DE-PRO MALDI-TOF);尼高力激光显微拉曼光谱仪(DXR)。

2 方法

2.1 菌株活化与种子培养液的制备

将冷冻保藏的长孢葡萄穗霉FG216于室温下解冻，取50 μL接种于PSA斜面培养基于25℃培养一周。将PSA斜面长孢葡萄穗霉FG216菌株接种于装有GSB种子培养基100 mL的500 mL锥形瓶中，25℃，180 r/min培养72 h即为种子培养液。

2.2 长孢葡萄穗霉FG216的发酵条件

取长孢葡萄穗霉FG216种子培养液以1%的接种量分别添加至5个含有发酵培养基200 mL的1 000 mL锥形瓶中，25℃，180 r/min发酵培养120 h。

2.3 FGFC1的提取与纯化

FG216发酵培养结束后，加入等体积的甲醇，超声处理15 min，10 000 r/min离心15 min，弃沉淀，上清液在40～60℃除去甲醇并减压浓缩至300 mL，调pH至3，分成3组，每组100 mL，分别加入不同的盐使其饱和度分别为20%，40%，60%，80%和90%，之后用乙酸乙酯萃取3次，每次100 mL，收集乙酸乙酯层，加入无水硫酸钠10 g，静置12 h，经过滤后减压浓缩至干，真空干燥12 h，溶于适量甲醇后用于HPLC分析。

采用半制备型高效液相色谱仪。流动相为甲醇-0.05 mol/L乙酸铵溶液(70∶30)，流速为10 mL/min，进样量为0.5 mL，检测波长为265 nm，用 Sepax HP-C18色谱柱(21.2 mm ×250 mm，10 μm)精制。

2.4 标准曲线的绘制与FGFC1含量分析

色谱柱为 Waters HP-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.05 mol/L 乙酸铵(70∶30)，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为265 nm。分别测定 FGFC1 的浓度为 40，60，80，100，200和500 μg/mL时的色谱峰面积。以FGFC1的浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，标准曲线方程为:Y=107 81 X，r=0.997 9。

采用上述方法测定粗提物中FGFC1的HPLC峰面积，重复3次，取平均值。由FGFC1浓度与峰面积的线性关系即可求得粗提物中FGFC1的浓度。

2.5 质谱分析

用0.1%三氟乙酸溶液-乙腈(50∶50)把 α-氰基-4-羟基-肉桂酸配制成5 g/L的基质溶液。FGFC1用甲醇配制成浓度为1 mg/mL的溶液。取样品溶液1 μL与饱和基质上清液1 μL混匀后在离子源加速电压分别为9和16 kV的条件下在500～1 000范围内扫描。

2.6 紫外光谱分析和拉曼光谱分析

将样品用甲醇配成10 μg/mL的溶液，用1 cm比色皿于190～400 nm波长范围内扫描。

激光显微拉曼光谱的激光波长为780 nm，波长扫描范围为200～3 300 nm。

3 结果与讨论

3.1 发酵液粗提物的HPLC图谱和FGFC1的保留时间

长孢葡萄穗霉FG216发酵液处理后，粗提物以甲醇-0.05 mol/L乙酸铵溶液(70∶30)为流动相经Waters HP-C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)分析的HPLC图谱如图1所示。图1A显示长孢葡萄穗霉FG216发酵液在无盐效应存在条件下乙酸乙酯萃取物主要成分有6种，其保留时间分别为8.172，9.525，11.519，13.528，16.860 和 22.138 min，其中保留时间为 16.860 min的物质为 FGFC1［7］，FGFC1 的峰面积最大。

图1 发酵液的无盐效应粗提物(A)和盐效应(氯化钠)粗提物(B)的HPLC图谱Fig.1 The chromatogram of HPLC from the crude extract of Stachybotrys longispora 216 culture by non-salt effect(A)and by salt effect(B)

3.2 盐效应对FGFC1提取效果的影响

长孢葡萄穗霉FG216发酵液处理后，分别在上清浓缩液中添加氯化钠、氯化铵和氯化钙至其饱和度为60%，经乙酸乙酯萃取后得到的FGFC1粗提物的HPLC图谱特性见表1。

表1 盐效应对FGFC1保留时间和提取率的影响Tab.1 Effects of retention time and extraction percentage of FGFC1 by salt effect

添加氯化钠、氯化铵和氯化钙在发酵液浓缩液中的浓度分别为 3.72，4.27 和 4.04 mol/L，即饱和度为60%的情况下，FGFC1保留时间与无盐效应的相比较，分别延长了0.12 s(图1B)，7.86 s(图未显示)和38.70 s(图未显示)。由标准曲线计算可得乙酸乙酯粗提物中有氯化钠、氯化铵和氯化钙等盐效应存在的条件下，FGFC1的浓度分别为18.8，8.43和9.42 mg/mL，与无盐效应的乙酸乙酯粗提物中的FGFC1的浓度16 mg/mL相比较其提取率分别为118%，53%和59%。

该结果清楚表明，加入氯化钠于发酵液浓缩液获得的粗提物中FGFC1的浓度最高，氯化钠盐效应具有优良的提取效果。

3.3 不同浓度氯化钠对FGFC1提取效果的影响

添加氯化钠在发酵液浓缩液中的饱和度分别为20%，40%，60%，80%和90%的情况下，测定了不同氯化钠浓度对FGFC1提取率的影响。

图2 盐饱和度对分离效果的影响Fig.2 The effect of salt saturation on the separation

图3 盐效应分离FGFC1的HPLC图谱Fig.3 The chromatogram of FGFC1 on salt effects

从图2看到，随着氯化钠饱和度从20%升高到90%，氯化钠盐效分离作用显著增强，饱和度达到60%以上时，氯化钠盐效分离作用趋于最大，达到18.8 mg/mL的提取浓度。同样是1价阳离子的铵根离子的盐溶液中，随着饱和度从20%升到60%，盐效分离作用增至最大，达到8.43 mg/mL的提取浓度，随着饱和度的增大，盐效分离作用降低。在2价阳离子钙离子的盐溶液中，随着饱和度从20%升到90%，盐效分离作用逐渐增大。

图2的结果显示，随着氯化钠、氯化铵和氯化钙的盐浓度从低到高，盐效分离作用效果基本呈现逐渐增强的趋势，但过高的氯化铵浓度减弱了分离FGFC1的盐效应。

3.4 盐效应对FGFC1的纯化作用

对通过氯化钠盐效应所得的粗提物用半制备型HPLC进行分离。FGFC1在半制备型HPLC的保留时间为51.738 min。收集的FGFC1溶出液纯度分析色谱图见图3。可以看出，FGFC1的单一峰显示在HPLC图谱上，没有其他杂质峰的出现，FGFC1通过盐效应被精制。

3.5 盐效应对FGFC1质谱和光谱特性的影响

精制的FGFC1经减压浓缩、冷冻干燥后用于化学特性的分析。FGFC1为黄色粉末，易溶于甲醇、氯仿、二甲亚砜等溶剂。其基质辅助激光解离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry)如图4所示。FGFC1主要离子碎片的质荷比(m/z)分别为 861(M+H)+，771，817，843，877，921。

图4 FGFC1的飞行时间质谱Fig.4 Time-of-flight mass spectrometry of FGFC1

图5 FGFC1的紫外吸收光谱Fig.5 The ultraviolet absorption spectrum of FGFC1

FGFC1紫外吸收光谱如图5所示，可见，在190～400 nm波长范围内，FGFC1在221，268和310 nm波长处有最大吸收，其摩尔吸光系数ε分别为4.01×104，1.53 ×104和 5.59 ×103。FGFC1 在 250 ～350 nm波长内显示中、低强度的吸收，说明羰基或共轭羰基的存在。

FGFC1的拉曼光谱表明 FGFC1在 3 297，2916，1624，1435，1379，1011cm－1处有吸收峰。3 297 cm－1为不饱和碳氢基团(=C－H)引起的伸缩振动(=C－H);2 916 cm－1为饱和碳氢基团(CH)引起的伸缩振动(C－H);1 624 cm－1为C=C引起的伸缩振动(C=C)，表明有C=C;1 435 cm－1为饱和碳氢基团(C－H)引起的弯曲振动(δC－H)，表明有－CH2或 －CH3，同时在1 379cm－1处有吸收峰，说明有－CH3;1 011 cm－1为C－O键引起的伸缩振动(C=O)，证明有-OH。

4 结论

本文基于盐效应理论，通过加入氯化钠、氯化铵或氯化钙三种盐改善FGFC1的萃取环境发现FGFC1在加入氯化钠的提取液浓度最大，提取率最高。与常用的甲醇提取法［1］相比，采用介于氯化钠盐效应的FGFC1分离方法能显著提高分离效果。

从盐效分离理论分析，盐在溶剂中的溶解度大小表征了溶剂分子能结合盐的数量，当盐在二溶剂中溶解度差越大时，盐效应也越大。氯化钠在水中和乙酸乙酯中的溶解度分别是0.110 0和0.000 5 mol/mol，氯化钙在水中和乙酸乙酯中的溶解度分别是 0.120 0 和0.106 8 mol/mol，在两种溶剂中氯化钠溶解度之差为0.109 5 mol，远大于氯化钙的0.003 2 mol，本文所得到结果和该理论相一致。

通过质谱、紫外光谱以及拉曼光谱分析了通过氯化钠盐效应分离得到的FGFC1的质谱和光谱特性，与采用无盐效分离方法的FGFC1的特性相比，两者的特性一致，采用氯化钠盐效分离FGFC1能达到分离目的。

［1］Kashinath R，Ratil A D，Tripathi.Thermodynamic properties of aqueous electrolyte solutions of LiCI，LiBr，LiI［J］.J Chem Eng Data，1990，35:166-168.

［2］孙仁义，张庆之.定标粒子理论预测乙醇-水体系汽液平衡盐效应［J］.高等学校化学学报，1996(4):601-606.

［3］郑学明，李坤英.盐效应对乙酸乙酯-甲醇-水体系液-液平衡的影响［J］.高校化学工程学报，1997(3):304-307.

［4］陈维苗，张雅明.醇-水-醋酸钠/碘化钾体系汽液平衡［J］.高校化学工程学报，2003(2):123-l27.

［5］齐 江，戴猷元.醇类稀溶液溶剂萃取的盐效应［J］.清华大学学报:自然科学版，2009，40(6):6-8.

［6］黄秀梨.微生物学实验指导［M］.北京:高等教育出版社，2005:114.

［7］张 艳，吴文惠，周培根.海洋微生物来源纤溶活性化合物的筛选及其分离［J］.中国海洋药物杂志，2008，27(6):39-43.