rhIL-12联合HBsAg刺激健康人外周血单核细胞对IL-12R的影响

李茹冰，李若冰，王翠玲，张宜俊，李 超，傅泳航

(1.广州军区广州总医院 药剂科，广东 广州 510010;2.广东省人民医院 心外科，广东 广州 510000;3.广州市恺泰生物科技有限公司，广东 广州 510620;4.解放军第四五八医院 检验科，广东 广州 510600)

白细胞介素-12(IL-12)是由35 kD的轻链和40 kD的重链组成的异源性二聚糖蛋白，由抗原递呈细胞在受到刺激后分泌。IL-12可启动细胞介导免疫，活化T细胞和NK细胞，增加Th1细胞数量，使其在细胞中占绝对优势，增强CD8+T细胞的细胞毒性［1］，并抑制Th2型细胞免疫，是形成特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的枢纽因子［2］，已经在不同模型动物的肿瘤和传染性疾病的治疗上显示出潜质［3-4］。傅泳航等［5］研究发现，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)联合重组鼠白细胞介素-12(rmIL-12)可明显增强免疫小鼠脾细胞分泌 γ-干扰素(IFN-γ)的水平，表明IL-12对于乙肝疫苗具有免疫增强作用，且导向Th1型免疫应答。吴长有等［6］发现，重组人白细胞介素-12(rhIL-12)促使慢性HBV携带者外周血单核细胞(PBMC)产生HBV特异的中枢记忆性CD8+T淋巴细胞的免疫应答，显示其在临床应用方面具有较好的发展潜力。本文对rhIL-12刺激健康人PBMC产生IFN-γ的细胞来源及对IL-12R的影响进行了研究。

1 材料

1.1 受试者

健康人8例，均曾接种过乙肝疫苗，HBV血清学指标如下:HBsAg(－)、抗 HBs(+)、HBeAg(－)、抗Be(－)、抗 HBc(－)。

1.2 试剂

rhIL－12(批号20080611)，广州市恺泰生物科技有限公司;重组HBsAg(rHBsAg)疫苗，深圳康泰生物制品股份有限公司;RPMI 1640、Hanks'液和胎牛血清，美国GIBCO公司;Ficoll淋巴细胞分离液，上海华精公司;人 IFN-γ酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒、TMB底物显色剂、CD3PE、CD8FITC、CD4PreCP、CD3FITC、CD56PE、IFN-γ、APC(别藻蓝蛋白，Allophycocyanin)、CD212(IL-12Rβ1)PE、CD212(IL-12Rβ2)PE、CD8 FITC(异硫氰酸荧光素)、CD4 APC、CD56PE-CY5，美国 BD 公司。

1.3 仪器

MultiskanMK3酶标仪，上海精科实业有限公司;FACS Calibur流式细胞仪，美国BD公司。

2 方法

2.1 人PBMC的分离

抽取8名健康志愿者静脉血10 mL，肝素抗凝。Hanks'液等体积稀释，用Ficoll进行密度梯度离心，8℃，2 000 r/min(离心半径18 cm)离心20 min，获取PBMC，充分洗涤后，用RPMI 1640完全培养液调整PBMC浓度为2 ×106/mL，备用。

2.2 体外诱导正常人PBMC产生IFN-γ

分组如下:(1)阴性对照组:培养液;(2)rHBsAg组:500 ng/mL;(3)rhIL-12 组:1.0 ng/mL;(4)联合组:500 ng/mL rHBsAg+1.0 ng/mL rhIL-12。

细胞培养板每孔中含细胞悬液及相应浓度刺激物各100 μL，各刺激物浓度均设6个复孔，置37℃，5%CO2培养箱培养72 h，ELISA测定培养上清中IFN-γ的浓度。

2.3 IFN-γ 的细胞来源测定

PBMC细胞分别加入4管15 mL细胞离心管中，每管1 mL，分组同2.2项。37℃，5%CO2温育24 h;温育至最后2 h加蛋白转运抑制剂(BFA)10 μL/mL，混匀。细胞用 pH 7.2，0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次(1 000 r/min，5 min)，用纸吸干后加固定液，每管各加4%PFA(多聚甲醛)2 mL，混匀，常温放置8 min;用PBS洗2次(2 000 r/min，10 min)，用纸吸干，各加破膜剂400 μL，4 ℃过夜;染色:每管两个组合，每组200 μL细胞。一组加入PE标记的CD3抗体、PreCP标记的CD4抗体、FITC标记的CD8抗体、APC标记的IFN-γ抗体;另一组加入FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD56抗体、APC标记的IFN-γ抗体。每种抗体加入量均为2 μL。4℃，避光30 min后用破膜剂洗2次;每管各加含0.1%BSA(牛血清白蛋白)的 PBS 300 μL，重悬细胞，采用流式细胞术检测CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK 细胞百分比。

2.4 细胞表面IL-12R测定

PBMC细胞分别加入4管15 mL细胞离心管中，每管1 mL，分组同2.2项。37℃，5%CO2分别温育72 h，细胞用PBS洗2次(1 000 r/min，5 min)，各加PBS 400 μL重悬细胞，染色:每管两个组合，一组加 PE标记的 CD212(IL-12Rβ1)、FITC标记的CD8、PE-CY5标记的 CD56、APC标记的 CD4;另一组加 PE标记的 CD212(IL-12Rβ2)、FITC标记的CD8、PE-CY5标记的CD56、APC标记的CD4。每组200 μL细胞，混匀染色30 min后用 PBS洗 2次(2 000 r/min，5 min)，用含 0.1%BSA 的 PBS 300 μL重悬细胞，采用流式细胞术分别测定CD4+、CD8+、CD56+细胞表面 IL-12Rβ1、IL-12Rβ2。

2.5 统计分析

数据用(x±s)表示，采用SPSS13.0统计软件进行重复测量方差分析，显著性水准为α=0.05，以P＜0.05为具有显著性差异。

3 结果

3.1 体外刺激PBMC产生特异性IFN-γ

用500 ng/mL rHBsAg或1.0 ng/mL rhIL-12单独刺激人PBMC时，发现仅有少量IFN-γ产生，而用HBsAg联合rhIL-12刺激时，发现所有人PMBC都能产生IFN-γ，而且 IFN-γ的平均水平显著高于单独使用rHBsAg组和rhIL-12组(P＜0.05)，见表1。

3.2 IFN-γ 的细胞来源

rhIL-12组CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比与对照组比较均有明显升高(P＜0.05);rHBsAg组各细胞百分率升高不如rhIL-12组，与对照组比较无显著差异(P＞0.05);rhIL-12与rHBsAg联合组CD8+IFNγ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比均较对照组明显升高(P＜0.01)，其中 CD56+IFN-γ +NK 细胞与 rHBsAg组比较均有显著差异(P＜0.05)，见表2。

表1 rhIL-12单独及与HBsAg联合对人PBMC产生IFN-γ影响(x±s)Tab.1 The comparison of IFN-γ induced by rhIL-12 alone and combined with rHBsAg in PBMC from the healthy(x±s)

表2 人PBMC与rhIL-12及rHBsAg孵育后IFN-γ+细胞百分数(x±s)Tab.2 The percentage of IFN-γ +cells in PBMC incubated with rhIL-12，rHBsAg and rhIL-12+rHBsAg(x±s)

3.3 PBMC细胞表面IL-12R增加

未经外源因子刺激的PBMC细胞表面IL-12R表达为对照组基础值，IL-12Rβ1和 IL-12Rβ2在健康人的表达水平无明显差异。

rhIL-12组表达 IL-12Rβ1和 IL-12Rβ2的各细胞亚群均有不同程度升高，且CD8+IL-12Rβ2和CD56+IL-12Rβ1上调幅度尤其明显，与对照组比较均有非常显著差异(P＜0.01)。

rHBsAg组细胞受体增加幅度大于rhIL-12组，其中CD56+IL-12Rβ1升高较之有非常显著意义(P＜0.01)。与对照组比较，CD4+IL-12Rβ1和 CD8+IL-12Rβ1、CD4+IL-12Rβ2 和 CD56+IL-12Rβ2均升高明显(P＜0.05);CD56+IL-12Rβ1和 CD8+IL-12Rβ2升高非常显著(P ＜0.01)。

rhIL-12与rHBsAg联合组β1和β2受体表达增加，与对照组比较均有显著差异(P＜0.01或0.01)，但CD4+IL-12Rβ2除外。联合组增加幅度大多明显高于单用rhIL-12或rHBsAg组，其中CD8+IL-12Rβ1和 CD56+IL-12Rβ1与单用 rhIL-12或 rHB-sAg组比较均有显著差异(P＜0.05或0.01)。

这表明rhIL-12和rHBsAg单独均能上调健康人PBMC表面IL-12R的表达，且rhIL-12联合rHB-sAg有增强作用，见表3。

4 讨论

HBsAg主要诱导体液免疫应答，如能使抗原特异性应答向Th1方向分化，并产生有效的CTL反应，对于乙型肝炎的预防和治疗均具有重要意义［7］。IL-12是一种能特异性增强Th1和CTL功能的细胞因子，在动物实验及临床观察中，均表现出较强的抑制病毒复制的作用。同时，IL-12也是一种有潜力的细胞免疫反应佐剂［8］。慢性乙肝患者特别是高HBV复制者IL-12的分泌及其免疫调节作用受到损害，CTL数量不足及功能低下与IL-12密切相关。IFN-γ主要由NK细胞和某些 T亚群包括NKT、CD8+T及 γ δ T细胞产生，Mφ、DC 和 B 细胞也能分泌IFN-γ［9］。IL-12通过诱生内源性IFN-γ，促进Th1细胞亚群发育，是IL-12抗HBV作用重要机制之一。因此，IL-12很可能在慢性乙肝的预防和治疗中起到积极作用。

表3 人PBMCs经刺激后各细胞亚群表达IL-12R的细胞百分数(x±s)Tab.3 The percentage of cell subgroup expressing IL-12R in PBMC stimulated by rhIL-12，rHBsAg and rhIL-12+rHBsAg(x±s)

rHBsAg或rhIL-12单独刺激健康人PBMC，仅产生少量IFN-γ，二者联合刺激产生 IFN-γ平均水平显著高于单用组。rhIL-12组CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比较对照组明显升高;rHBsAg组各细胞百分率升高不如rhIL-12组，联合组CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比均较对照组明显升高，其中CD56+IFN-γ+NK细胞与rHBsAg组比较均有显著差异，提示rhIL-12诱生的 IFN-γ主要来自CD56+NK细胞、CD8+T细胞，其次是CD4+T细胞，rhIL-12与rHB-sAg联合具有增强作用。

IL-12的生物学活性具有专一性，必须由高亲合力的IL-12R来介导。IL-12对于自身受体的调节起着非常重要的作用。未致敏Th细胞不表达 IL-12Rβ2，当抗原与 TCR 结合后，IL-12Rβ2低水平表达，有IL-12存在时，功能性IL-12R表达大大增加。因而IL-12和IL-12R结合后通过复杂的信号转导途径，促进Th1或NK细胞的活化，而发挥其生物学功能。本研究结果表明，rhIL-12组表达β1和β2受体的各细胞亚群均有不同程度升高，且 CD8+IL-12Rβ2和CD56+IL-12Rβ1上调幅度尤其明显，rHBsAg组增加幅度大于rhIL-12组，联合组β1和β2受体表达增加幅度大多明显高于单用组，表明rhIL-12和rHBsAg单独均能上调健康人PBMC表面IL-12R的表达，且rhIL-12联合rHBsAg有增强作用。研究显示，rhIL-12对CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD56+NK细胞表面表达IL-12Rβ1和IL-12Rβ2起着非常重要的作用，rhIL-12与rHBsAg联合组对受体表达的影响明显高于单用rhIL-12或rHBsAg组。这表明rhIL-12和rHBsAg单独均能上调健康人PBMC表面IL-12受体的表达，且rhIL-12联合rHBsAg有增强作用。

上述结果显示，rhIL-12与rHBsAg联合主要通过诱导 T细胞和 NK细胞大量分泌 IFN-γ，调节Th1/Th2，上调IL-12受体的表达来促进免疫应答，进而达到抑制HBV复制或者清除HBV。

［1］Kang B Y，Kim E，Kim T S.Regulatory mechanisms and their therapeutic implications of interleukin-12 production in immune cells［J］.Cell Signal，2005，17(6):665-673.

［2］Cooper D，Pride M W，Guo M，et al.Interleukin-12 redirects murine immune responses to soLuble or aluminum phosphate adsorbed HSV-2 gLycoprotein D towards Th1 and CD4+CTL responses［J］.Vaccine，2004，23(2):236-246.

［3］Gupta S，Boppana R，Misha G C，et al.Interleukin-12 is necessary for the priming of CD4+T cells required during the elicitation of HIV-1 gp120-specific cytotoxic T-lymphocyte function［J］.Immunology，2008，124(4):553-561.

［4］Tsai Y S，Shiau A L，Chen Y F，et al.Enhancement of antitumor immune response by targeted interleukin-12 electrogene transfer though antiHER2 single-chain antibody in a murine bladder tumor modeL［J］.Vaccine，2009，27(39):5383-5392.

［5］傅泳航，杨向阳，李茹冰，等.乙型肝炎表面抗原联合rmIL-12诱导的小鼠细胞免疫应答［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(12):1199-1202.

［6］吴长有，杨滨燕，朱兆玲，等.在单个细胞水平上分析抗原特异性Th1/Th2细胞因子产生的关联性［J］.免疫学杂志，2005，21(1):9-12.

［7］吴长有，刘 杰.利用多种表面标志鉴别正常人外周血初始和记忆 T 细胞亚群［J］.免疫学杂志，2006，22(2):120-123.

［8］Wright A K，Briles D E，Metzger D W，et al.Prospects for use of interleukin-12 as a mucosal adjuvant for vaccination of humans to protect against respiratory pneumococcal infection［J］.Vaccine，2008，26(38):4893-4903.

［9］Bream J H，Curiel R E，Yu C R，et al.IL-4 synergistically enhances both IL-2 and IL-12 induced IFN-γ expression in murine NK cells［J］.Blood，2003，102(1):207-214.