UPLC-MS/MS测定黑小麦中B族维生素

韩 豪，李新生，2，3，高 玥，刘 新，杨智勇，马娇燕

(1.陕西理工学院，2.陕西省资源生物重点实验室，3.陕西省黑色有机食品工程技术研究中心，陕西 汉中723000)

B族维生素是一类水溶性物质，主要包括硫胺素(维生素 B1，VB1)，核黄素(维生素 B2，VB2)和吡哆素(维生素B6，VB6)等。VB1具有醛基转移和α-酮酸的脱羧作用，缺少它会得脚气病、神经性皮炎等。VB2在生物体内起传递氢的作用，缺少时易患口腔炎、皮炎、微血管增生等。VB6是氨基酸转氨基、脱羧作用，是合成神经递质的必需品［1-2］。

目前B族维生素的检测方法很多，我国食品卫生标准分析方法中对VB1采用荧光法，药典中对VB1、VB6采用分光光度法［3］，国际上通用的关于 B族维生素的检测方法大多为20多年前建立的微生物法［4］。这些方法仅能测定其中的单一组分，且步骤烦琐，对于某些食物样品，还要用专门的萃取方法除去干扰物后才能测定。近年来国内外学者对多种B族维生素的同时测定进行了大量研究，建立了许多分析方法，如高效毛细管电泳法［5-6］和高效液相色谱法［7-12］。本研究建立了超高效液相-三重四极杆串联质谱(UPLC-MS/MS)法，高效快速检测 VB1、VB2和VB6的含量。

1 材料

5个黑小麦样品 YK-1、YK-2、YK-3、YK-5 和YK-6，由西北农林科技大学提供。

VB1(含量98%)、VB2(含量98%)和VB6(含量100%)对照品，购于天津一方科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯。

UPLC-MS/MS联用仪，配电喷雾离子源(ESI)，美国Waters公司;LC-800离心机，科大创新股份有限公司;SK-120E超声波清洗机，宁波科生仪器厂。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm);柱温:35 ℃;进样量:10 μL。流动相:A相为乙腈，B相为0.1%甲酸溶液，采用梯度洗脱:A 相 0～4.0 min由 95%变为 20%、4.0～7.0 min由20%变为80%、7.0～8.0 min由80%变为95%;流速:0.3 mL/min;分析运行时间8 min。

2.2 质谱条件

离子源:ESI;扫描方式:正离子扫描;检测模式:多反应监测;毛细管电压:3 kV;离子源温度:150℃;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:650 L/h;锥孔气流量:50 L/h。

2.3 标准溶液的配制

分别称取 VB1、VB2和 VB6对照品 1.95，1.01和2.07 mg，置25 mL量瓶中，用1%甲酸溶液溶解并稀释至刻度，得浓度分别为78，40.28 和82.8 μg/mL的VB1、VB2和VB6标准储备液。

取上述标准储备液，逐级稀释得浓度分别为31.2，62.4，93.6，124.8 和 156 ng/mL 的 VB1标准溶液，浓度分别为 32.22，64.44，96.66，128.88 和161.10 ng/mL 的 VB2标准溶液，浓度分别为 16.56，33.12，49.68，66.24 和82.80 ng/mL 的 VB6标准溶液。

2.4 定量限实验

分别取VB1、VB2和VB6标准溶液逐级稀释，在相同的液相质谱分析条件下进样分析，以S/N=10，确定VB1、VB2和VB6的定量限。

2.5 样品溶液制备

称取黑小麦全粉20 g，用滤纸包好，加入石油醚150 mL，在60℃下索氏提取2 h。将脱脂后的黑小麦全粉置于50 mL棕色量瓶中，加入1%甲酸溶液50 mL，室温下用超声波提取20 min，冷却后，4 000 r/min离心15 min，倒出上清液，将沉淀转入量瓶中。重复以上步骤，再超声提取两次，合并三次提取液。加入淀粉酶1 mL，酶解1 h，再加入糖化酶1 mg，酶解 1 h。加 1% 甲酸溶液至 250 mL。0.2 μm过滤器过滤后，注入UPLC-MS/MS仪检测。

3 结果

3.1 质谱条件的优化

首先将浓度在500～1 000 ng/mL的3个维生素标准溶液，分别在ESI正离子模式下进行母离子全扫描，确定了VB1、VB2和VB6的分子离子［M+H］+ 为 m/z 265.93、m/z 377.06 和 m/z 170.04。然后以m/z 265.93、m/z 377.06 和 m/z 170.04 为母离子，对其子离子进行全扫描，在2.2项质谱条件下，VB1主要有 m/z 143.97、m/z 122两个子离子，其质谱图如图1所示;VB2主要有m/z 243、m/z 172两个子离子，其质谱图如图2所示;VB6主要有m/z 134、m/z 76.96两个子离子，其质谱图如图3所示。本方法选择丰度较高，干扰较小的离子对(m/z 265.93 ＞ 143.97，265.93 ＞ 122;377.06 ＞ 243，377.06 ＞172;170.04 ＞134，170.04 ＞76.96)作为定性离子对，选择丰度最高的离子对(m/z 264.93＞122，377.06 ＞ 172，170.04 ＞ 76.96)作为定量离子对，在此基础上重点优化了碰撞电压和锥孔电压。得到最佳锥孔电压和碰撞电压，如表1所示。

图1 VB1质谱图Fig.1 Mass spectra of VB1

图2 VB2质谱图Fig.2 Mass spectra of VB2

图3 VB6质谱图Fig.3 Mass spectra of VB6

表1 最佳锥孔电压和碰撞电压Tab.1 The best cone voltages and collision voltages

3.2 线性范围和定量限

以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)拟合标准工作曲线，VB1、VB2和VB6的回归方程和相关系数分别为 Y=62.94 X －349.38(r=0.999 8)，Y=120.62 X+2 323.27(r=0.999 9)，Y=271.16 X+4 406.22(r=0.999 9)，在20 ～200 ng/mL 范围内线性关系良好。将这三个标准品的标准溶液逐级稀释，以 S/N=10，得 VB1、VB2和 VB6的定量限分别为 0.62，0.32 和 0.50 ng/mL。

3.3 精密度试验

取同一对照品溶液，连续进样6次，每次进样10 μL，测定 VB1、VB2和 VB6的峰面积，结果 VB1、VB2和VB6峰面积的 RSD(n=6)分别为0.21%，0.11%和 0.15%。

3.4 重复性和稳定性试验

精密称取6份YK-1黑小麦样品，按照2.5项下方法制备样品溶液，以上述色谱和质谱条件进样分析，计算黑小麦(YK-1)VB1、VB2和VB6含量的RSD(n=6)分别为 0.87%，0.69% 和 0.77%，表明该方法的重复性良好。

取同一供试品溶液，在室温下，分别于制备后0，3，6，9 和12 h 进样测定，结果 VB1、VB2和 VB6的RSD(n=6)分别为 1.51%，1.09% 和 1.24%，表明VB1、VB2和 VB6在12 h内稳定。

3.5 回收率试验

准确称取已知 VB1(1.792 μg/g)、VB2(0.875 μg/g)和 VB6(0.554 μg/g)含量的同一批次 YK-1黑小麦全麦粉20 g，5份，分别加入VB1(62.4 ng/mL)，VB2(32.22 ng/mL)，VB6(16.56 ng/mL)对照品溶液1 mL。按照2.5项下方法制备样品溶液，进样测定。VB1的平均回收率为97.50%，RSD为3.09%;VB2的平均回收率为 97.91%，RSD 为3.90%;VB6的平均回收率为 99.32%，RSD 为2.84%。见表 2。

表2 VB1、VB2和VB6的回收率Tab.2 Recovery of VB1，VB2and VB6

3.6 样品含量测定

分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各10 μL，注入UPLC-MS/MS仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中VB1、VB2和VB6的含量。色谱图见图4～6。从表3可见，黑小麦VB1的含量为0.965 ～1.961 μg/g，黑小麦 VB2的含量为 0.614～0.963 μg/g，黑小麦 VB6的含量为 0.364 ～0.625 μg/g。不同品种黑小麦VB1、VB2和VB6的含量存在较大差异。

图4 VB1标准溶液(A)和黑小麦YK-1(B)总离子色谱图Fig.4 Total ion current of VB1solution and black wheat(YK-1)

4 讨论

小麦中B族维生素主要存在于小麦的胚芽和种皮中，小麦的胚芽和种皮中均含有脂溶性成分，而维生素为水溶性化合物，因此，黑小麦全麦粉经脱脂后有助于维生素的提取。黑小麦全麦粉中淀粉含量较高，因此提取温度不宜过高，否则淀粉糊化后会降低维生素的溶出率。

图5 VB2标准溶液(A)和黑小麦YK-1(B)总离子色谱图Fig.5 Total ion current of VB2solution and black wheat(YK-1)

图6 VB6标准溶液(A)和黑小麦YK-1(B)总离子色谱图Fig.6 Total ion current of VB6solution and black wheat(YK-1)

表3 黑小麦中VB1、VB2和VB6的含量Table.3 The content of VB1，VB2and VB6in black wheat samples

本文对溶解维生素的溶剂进行筛选，采用50%甲醇、水、甲醇(1%甲酸)、50%甲醇(1%甲酸)、1%甲酸溶液配制VB1、VB2、VB6标准溶液，在确定的液相和质谱条件下，采用多反应监测模式监测，结果表明50%甲醇、甲醇(1%甲酸)、50%甲醇(1%甲酸)均出现峰拖尾的现象，水配制的标准溶液响应值较低，而以1%甲酸溶液配制的标准溶液，响应值最高。

在本研究中，样品前处理过程简单、时间短，VB1、VB2和VB6在20～200 ng/mL范围内线性关系良好;加样回收率分别为97.50%，97.91%和99.32%。黑小麦中 VB1、VB2和 VB6的含量分别为0.965～1.961，0.614 ～0.963 和 0.364 ～0.625 μg/g。本研究为谷类作物以及食品、化妆品和医药行业中VB1、VB2和VB6含量的检测提供一种快速、高灵敏度、高选择性的检测手段。

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