荧光PCR法对麻风现症患者与治愈者鼻分泌物麻风杆菌检测结果分析

蔡銮端 郑迪楠 郑华生 林 旸 郑睦畅

目前，麻风病在我国总体处于低流行水平，但每年仍有不少新发和复发病例。迄今为止，麻风杆菌的体外培养仍未成功，因此，建立检测病原菌的方法尤为重要。荧光定量PCR是检测麻风杆菌的新方法。过去认为麻风病通过皮肤直接接触传播，现在多数学者认为麻风病的传播来源主要是鼻粘膜。为了解荧光定量PCR对鼻分泌物麻风杆菌检测在麻风病诊治及了解联合化疗(MDT)的效果和复发方面的情况，笔者于2010年5月～2012年7月对汕头市澄海区的5例麻风现症患者的不同时期，以及32例历年经联合化疗(MDT)治愈的麻风存活者鼻分泌物进行荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA，同时与皮肤组织液同样作PCR检测结果作对照，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 标本来源于5例麻风现症患者和32例历年经麻风联合化疗治愈者。5例麻风现症患者中4例为多菌型（皮肤组织液抗酸染色均为阳性），1例为少菌型（抗酸染色阴性）；32例历年存活者经WHO推荐的麻风联合化疗方案（多菌型方案DDS+RFP+B663三联治疗2年或治愈；少菌型方案DDS+RFP6个月～1年）治愈，其中多菌型23例，少菌型9例，已治愈5～10年7例，已治愈＞10年25例。研究组41份鼻分泌物样本来自的5例现症患者治疗前和4例多菌型现症患者治疗半年期及32例历年治愈者，对照组标本取同一对象的皮肤组织液。

1.2 标本采集和处理 （1）鼻拭子标本：用拭子伸入被检者鼻腔深处，紧贴鼻腔粘膜旋转2～3周后取出，装入拭管中冷藏；（2）皮肤组织液标本：取被检对象浸润明显的活动性皮损或眶上、颧部、下颌和耳垂至少2个部位的皮肤组织液。常规消毒皮肤，戴消毒手套，用左手将患者皮肤捏紧提起使局部皮肤变白，右手切开一长5mm、深3mm的切口，用刀刃刮取组织液，粘于灭菌拭子放入密闭的离心管后冷藏。

1.3 麻风杆菌DNA的提取 麻风杆菌核酸荧光PCR检测试剂盒是美国BioXL公司提供，按试剂盒的说明将待测标本加生理盐水1mL充分混匀，10000r离心5min，弃上清液，再加50μL核酸提取液B后充分混匀，100℃处理10min，10000r离心5min后，取上清液4μL做PCR反应。

1.4 PCR扩增 扩增仪采用广州中山大学达安公司的DA7600全自动基因扩增仪,每个反应管加入26μL试剂（MLPCR MIX 24μL+Taq酶系2μL），加入处理后DNA样本或阳性定量标准品梯度（使用前用阴性质控品将ML-阳性标准品（1×107COPIES/mL）梯度稀释10倍、100倍、1000倍，记为1×106COPIES/mL，1×105COPIES/mL，1×104COPIES/mL）和阴性质控品4μL，10000r 30s。反应条件：93℃→2min，后93℃5s→56℃ 45s，共40个循环。

1.5 结果判定 调节标准曲线至最佳，仪器自动分析计算出待测标本数值，阴性为＜103COPIES/mL；阳性为≥103COPIES/mL（不同级别拷贝数103或104、105、106）。

1.6 统计学方法 采用SPSS12.0软件进行统计学分析，计数资料用χ2检验进行统计分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组和对照组荧光PCR结果阳性率比较 41份鼻分泌物标本经荧光PCR检测麻风杆菌DNA结果阳性7份，阴性34份；对照组皮肤组织液标本经荧光PCR检测麻风杆菌DNA结果阳性8份，阴性33份，两组检测结果阳性率比较，差异无统计学意义（χ2=0.082，P＞0.05），见表1。

表1 两组标本PCR阳性率比较

2.2 麻风现症患者荧光PCR检测结果 麻风现症患者不同时期的9份鼻分泌物标本（其中来自抗酸染色阳性的多菌型患者8份和抗酸染色阴性的少菌型患者1份）荧光定量PCR检测阳性7份，阴性2份；对照组9份皮肤组织液标本经荧光PCR检测麻风杆菌DNA结果阳性8份，两组具体拷贝数量级分布情况见表2，两组阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 32例经联合化疗治愈者PCR检测结果 未发现复发者，与临床相符。32例治愈者的鼻分泌物样本32份和皮肤组织液样本32份做荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA均为阴性。

表2 麻风现症患者荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA结果

3 讨论

自1981年WHO推出MDT治疗麻风病已经实施20余年，治愈了一大批麻风现症患者。但近10年每年新发病例无明显下降趋势，一个重要原因是对麻风的传播途径未了解透彻[1]。而多菌型患者带菌的鼻和上呼吸道作为传染源越来越被重视。目前涂片抗酸染色镜检仍是麻风诊断和观察疗效的常规检查方法。随着分子生物技术的发展和成熟，敏感性和特异性皆高的分子生物学方法的研究应用将提高麻风病的早期诊断水平，阻断其传播，降低其新发病例。对于全球麻风流行的控制措施尤其重要[1]。

迄今麻风杆菌的体外培养仍未成功，因而建立检测病原菌的方法尤为重要。目前PCR就成为研究麻风分枝杆菌的理想选择。荧光定量PCR与普通PCR的不同，其采用闭管，无需PCR后处理，避免污染和假阳性；探针与DNA特异杂交，增强了特异性；可定量；检测结果由光谱分析仪自动显示，增强了灵敏性和客观性。这种实时PCR改善了许多病原体的分子诊断，其优点在于能定量检测临床标本的DNA。有报道[2]此法已应用于麻风病临床标本的检测，特别是用在常规组织学染色不能检测到菌的标本。Bang等[3]选择了37例MB(多菌型）患者和32例PB(少菌型）患者进行PCR技术和其它传统方法的比较。其中MB患者的BI(细菌密度）均为阳性，而PCR的阳性率为100%，PB患者的BI均为阴性，而PCR的阳性率为50%。因此相比较于传统诊断方法，对于菌量较少的患者，PCR有其优越性。

本研究中，鼻分泌物组和皮肤组织液组检测麻风菌结果基本一致，阳性率很接近，表明荧光定量PCR检测鼻分泌物麻风杆菌DNA是可行的。另外，这种方法创伤小或无创伤，更易被患者接受。本研究PCR检测结果同常规诊断结果基本相符。熊俊浩等[4]用麻风分枝杆菌PCR技术，以16SrRNA作引物，对麻风流行地区的72例经传统方法诊断的麻风病患者和45例健康自愿受试者进行检测，结果与传统方法诊断基本一致。

评价MDT疗效的最重要的指标是完成治疗后的复发率。本研究中，检测结果与临床相同，未见复发；对32例皮肤组织液做荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA，结果均为阴性。

从本研究中可以看出，联合化疗治疗麻风病效果好，复发少。荧光定量PCR检测鼻分泌物麻风杆菌DNA可做为诊断和监测麻风的新方法。由于病例较少，还有待进一步研究探讨。

[1]田蔚蔚.麻风杆菌的分子生物学检测研究进展[J].中国麻风皮肤病学杂志，2010，26（6）：416-418.

[2]吴勤学，宋顺鹏，吕成志，等.麻风分子生物学研究新进展[J].中国麻风皮肤病学杂志，2010，26（2）：121-122.

[3]Bang PD,Suzuki k,phuong LT,et al.Evaluation of Polymerase Chain reaction-based detection of Mycobacterium Leprae for the diagnosic of leprosy[J].J Dermatol,2009,36（6）：269-276.

[4]熊俊浩，雍刚，喻林冲.多聚酶链技术在麻风诊断中的应用研究[J].预防医学情报杂志，2001，17（2)：68-69.