促熟干酪的非发酵剂乳酸菌筛选及其对干酪浆模型蛋白质降解的研究

周 蕊，李晓东，潘 超

(乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

促熟干酪的非发酵剂乳酸菌筛选及其对干酪浆模型蛋白质降解的研究

周 蕊，李晓东*，潘 超

(乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

从中国传统发酵食品酸菜中分离筛选促进干酪成熟的非发酵剂乳酸菌，并研究其对干酪浆蛋白质降解的影响。应用ROGOSA琼脂从东北农家酸菜中分离菌株，采用多元统计分析法进行复筛，通过16S rDNA基因序列分析鉴定筛选菌株，最后研究筛选菌株对干酪浆蛋白水解特性的影响。结果表明：从酸菜中筛选出一株可以促进干酪成熟的非发酵剂乳酸菌S-1，经16S rDNA基因序列分析鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ)，此菌株产酸能力低，具有较高的自溶度与氨肽酶活力，在干酪浆模型成熟过程中表现出较强的蛋白水解能力。

干酪；促熟；酸菜；非发酵剂乳酸菌；筛选；鉴定；蛋白质降解

干酪成熟是一个缓慢且昂贵的过程，因此干酪的促熟受到人们的普遍关注。促熟发酵剂是经过精细筛选并添加至新鲜干酪中可以加快干酪成熟的一类微生物[1]。非发酵剂乳酸菌(nonstarter lactic acid bacteria，NSLAB)可作为促熟发酵剂加速干酪成熟，逐渐成为干酪促熟方法的研究热点。NSLAB在干酪成熟过程中通过直接代谢或释放各种酶到干酪结构中，对干酪质构的变化和风味的形成有着重要贡献[2]。目前，一些研究表明NSLAB有利于加速干酪成熟并提升风味，但也有研究证明某些菌株能够产生消极影响。因此，筛选适宜的NSLAB就显得尤为重要。

由于干酪成熟时间长，研究人员建立干酪浆模型快速准确评价添加菌株对干酪成熟的影响。干酪浆模型中水分含量较高并采用较高的成熟温度(30～32℃)，从而起到快速成熟的效果，研究者将其作为一种快速可靠的工具来评价添加物对干酪成熟的影响[3]。

在国外，原料乳与奶酪是筛选NSLAB的普遍来源，而从非乳来源筛菌的研究是有限的[4]。中国传统发酵食品微生物资源丰富，从中筛选具备促熟发酵剂特征的NSLAB具有一定的可行性。本实验从酸菜中初步筛选革兰氏阳性无芽孢杆菌，由于菌株的生物学特性具有相关性，所以本课题组以产酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解能力为指标，通过多元统计方法复筛出综合性能较强的非发酵剂乳酸菌菌株，利用干酪浆模型快速评价菌株的蛋白降解能力，为获得优良的促熟发酵剂提供菌源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验室自制自然发酵酸菜，腌制好的样品装入灭菌玻璃瓶中，密封。

细菌基因组DNA提取试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；L-亮氨酸对硝基苯胺 美国Sigma公司；16S rDNA序列扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 仪器与设备

BS203光学显微镜 重庆光学电子设备有限责任公司；UV-6000pc紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ冷冻离心机 无锡建议实验器材有限公司；PHS-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；SYQ-DSX-280B手提式蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 非发酵剂乳酸菌的初筛

将酸菜的菜叶和汁水均质，匀浆过滤后以pH6.8的PBS缓冲液梯度稀释，吸取适宜稀释度溶液100μL倾注于无菌培养皿，与调整的ROGOSA琼脂培养基(4g/100mL NaCl，pH5.0，近似干酪成熟环境)混匀，30℃厌氧条件下培养36～72h。挑取典型菌落转接到MRS平板纯化，镜检选取革兰氏阳性无芽孢杆菌转接入MRS液体培养基增菌，获得乳杆菌菌株并保存。

1.3.2 非发酵剂乳酸菌的复筛

菌株的产酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解能力具有相关性[5]，以这些生物学特性为指标采用多元统计法进行复筛。

1.3.2.1 产酸能力测定

菌株接入MRS液体培养基中30℃培养24h，连续活化两代，调整菌体悬浮液初始OD650nm为1.0，以体积分数2%的接种量接入10g/100mL灭菌脱脂乳培养基中30℃培养24h，接菌后相隔24h测定pH值，以ΔpH表示菌株的产酸能力[6]。

1.3.2.2 自溶度测定

菌株活化两代后，冷冻离心(10000×g，10min，4℃)，得到的菌体悬浮于0.2mmol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液中，调整初始OD650nm为0.6～0.8，置于30℃培养箱，间隔24h后测定OD650nm的变化[7]。

1.3.2.3 氨肽酶活力测定[8]

采用LNA法：取3mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7.8)、底物Lysine-p-nitroanilide(16.4mmol/L)和稀释一定倍数的菌液混匀在37℃保温10min，0.5mL、30%乙酸终止反应，在波长405nm处比色测定酶活力。空白对照管不放入菌液。酶活力单位定义为：37℃时，每分钟生成1μmol对硝基苯胺为一个酶活力单位，用U表示。

1.3.2.4 菌株乳蛋白水解能力测定

参考Church等[9]的邻苯二甲醛(OPA)方法绘制0.1～3mmol/L甘氨酸标准曲线，并且测定菌株乳蛋白水解能力。OPA现配现用，避光保存。菌株以1%接种量接种于12g/100mL脱脂乳中，于37℃培养24h，以未接菌的10g/100mL脱脂乳作为空白。5mL样品、1mL重蒸馏水和1mL 0.75mol/L三氯乙酸混匀，静置10min，3000r/min离心5min，将1mL上清液与3mL OPA试剂混匀，反应2min，于340nm波长处测吸光度。对应标准曲线得出蛋白水解活性相当于甘氨酸的量，以A340nm作为OPA指数也可直接对比。酶活力单位定义：在37℃，每分钟分解牛奶蛋白产生1μmol甘氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

式中：K为酶液稀释倍数；W为生成的甘氨酸量/μmol； V为反应酶液体积/mL；t为反应时间/min。

1.3.2.5 数据分析

由于产酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解能力彼此有一定的相关性，因而所得的统计数据反映的信息在一定程度上有重叠。为了全面、系统地分析问题，采用SPSS16.0统计软件中主成分分析法把多指标转化为少数几个综合指标去解释大部分资料中的变异。因此，利用主成分分析法对产酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解能力4个指标进行统计分析。

1.3.3 菌属鉴定

采用16S rDNA基因测序法鉴定菌株。PCR扩增引物F27 (5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)及R1541(5＇-AAGGAGGTGATCCAGCC-3＇)。PCR反应条件：94℃、5min；94℃、1min，58℃、1min，72℃、2min，30个循环；最后72℃、10min。产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后测序。利用Blast软件，将测序结果输入GenBank，确定目的基因的同源性[10]。

1.3.4 干酪凝乳的制作工艺流程

原料乳→杀菌(65℃，30min)→冷却(30℃)→接菌种→搅拌→静置发酵→添加凝乳酶→搅拌→凝乳→切割→热烫排乳清→凝块堆砌(至排出乳清pH值降至5.5)→切块即得干酪凝乳

1.3.5 干酪浆模型的制作

取100g上述干酪凝乳装入无菌搅打机中，加入50mL 5g/100mL的灭菌氯化钠溶液(对照组)或47mL 5g/100mL的灭菌氯化钠溶液和3mL(接菌量为3%)的菌株脱脂乳(实验组)，在搅打机中搅打成浆状。对照组与实验组在30℃厌氧箱中培养[11]，分别于0、2、5、7、10d取样分析。上述操作均在无菌操作室内进行，制作过程中所用的搅拌器及切割刀等所用器具使用前蒸汽灭菌(121℃，60min)。

1.3.6 菌株在干酪浆模型成熟过程中蛋白质降解的测定

1.3.6.1 pH4.6可溶性氮含量测定

采用Agboola等[12]的方法。

1.3.6.2 三氯乙酸可溶性氮(TCA-N)含量测定

取pH4.6可溶性氮上清液16mL，加入4mL 12% TCA，静置1h，用Whatman 1#滤纸过滤。上清液10mL进行凯氏微量定氮，以占干酪总氮量的百分数表示。

2 结果与分析

2.1 非发酵剂乳酸菌的初筛

挑取典型菌落接种于MRS琼脂培养基，划线分离得到24株纯培养菌株。显微镜观察后保留了1 8株革兰氏阳性无芽孢杆菌，将分离菌株编号为S-1～S-1 8。

2.2 非发酵剂乳酸菌的复筛

2.2.1 产酸能力比较

NSLAB是干酪微生物中的一种独特菌群，在干酪生产过程中对产酸、凝乳贡献不大[13]。NSLAB定义为在干酪中发现的不是发酵剂成分的乳酸菌，也就是说，在干酪生产过程中，对于酸的产生不起作用，应筛选产酸能力较低或不产酸的菌株。

由表1可知，S-1菌产酸能力最弱，ΔpH为0.63，S-2、S-8、S-9菌株产酸能力较高，ΔpH分别为1.32、1.25和1.16，其余各菌株产酸能力约为1。

表1 18株菌株的ΔpH、自溶度、蛋白水解能力与氨肽酶活力的测定结果Table1 Properties of 18 strains isolated from

表1 18株菌株的ΔpH、自溶度、蛋白水解能力与氨肽酶活力的测定结果Table1 Properties of 18 strains isolated from

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

菌株编号ΔpH(24h)自溶度/%蛋白水解能力/(U/mL)氨肽酶活力/(U/mL) S-10.63±0.101d31.64±0.814a2.553±0.009e14.767±0.153aS-21.32±0.301a27.23±0.797bc3.091±0.059a2.733±0.208fS-31.09±0.045bc26.76±0.661bc2.089±0.003i4.567±0.551dS-41.07±0.047bc27.23±0.359bc1.929±0.006j3.433±0.153efS-51.08±0.056bc26.93±0.42bc2.172±0.01h1.600±0.265gS-60.99±0.026c31.03±0.551a2.072±0.048i6.700±0.625bS-71.01±0.036c21.99±0.496d1.912±0.009j4.000±0.500deS-81.25±0.062ab28.26±0.427b2.821±0.024b4.200±0.265deS-91.16±0.07b24.31±0.498cd2.435±0.050f4.633±0.322dS-101.01±0.121c29.74±0.1ab1.856±0.007k4.067±0.503deS-111.07±0.07bc27.68±0.666bc1.804±0.052k3.700±0.200eS-121.07±0.01bc25.62±0.776bc2.759±0.039c5.733±0.808cS-131.06±0.044bc20.29±0.385d2.094±0.034i5.400±0.458cS-140.96±0.036c25.47±0.986c2.467±0.003f6.567±0.322bS-151.01±0.03c23.71±0.184cd1.499±0.011l5.033±0.252cdS-161.03±0.011bc14.85±0.346e1.921±0.026j2.833±0.208fS-171.06±0.031bc26.22±0.683bc2.333±0.052g4.533±0.306dS-181.06±0.04bc23.42±0.21cd2.69±0.003d5.467±0.252c

2.2.2 自溶度结果分析

干酪成熟过程中，非发酵剂乳酸菌细胞的快速自溶可以促进胞内肽酶的及早释放并能在干酪中保持活性，使得游离氨基酸增多且降低苦味形成[14-15]。由表1可以看出，18株菌株的自溶度范围(14.85%～31.64%)分布较广，其中90%的菌株的自溶度值在20.29%～29.74%之间，S-1号与S-6号菌株的自溶度达到30%以上，分别为31.64%和31.03%。

2.2.3 氨肽酶活性结果分析

研究发现氨肽酶具有降解疏水性氨基酸和降低苦味的潜力，高肽酶活力特别是低产酸能力的菌种的添加对干酪促熟具有非常大的作用[16]。这一点表明NSLAB的胞内酶活力，尤其是高氨肽酶活力的重要性。

由表1可知，S-1号菌株的氨肽酶活性显著高于其他菌株，为14.767U；S-6号与S-14号菌株的氨肽酶活力相当，低于S-1号菌株，分别为6.7U和6.567U，其余菌株的氨肽酶活力值相差较大，从1.600U到5.733U之间变化。

2.2.4 菌株乳蛋白水解情况分析

由表1可知，不同菌株之间蛋白水解能力差异显著(P＜0.05)。S-2菌株的蛋白水解能力较强，为3.091U/mL；S-8号和S-12号菌株蛋白水解能力次之，分别为2.821U/mL和2.759U/mL。

蛋白质水解的速率很大程度上决定着干酪成熟期的长短，加快干酪蛋白质水解速率可以缩短成熟时间。非发酵剂乳酸菌中的酶类可以水解乳中蛋白质，将多肽释放于培养基中，再经肽酶进一步水解为更小的肽类或氨基酸[17-18]。但是，强蛋白水解能力能够引起苦味肽与不良物质的生成，使干酪质地变软。

2.2.5 菌株生物学特性的多元统计筛选

以产酸能力、自溶度、氨肽酶活性和蛋白水解能力为筛选指标应用主成分分析法对18株菌株进行复筛，结果如表2所示。

表2 方差的主成分提取分析Table2 Variance analysis for major properties of 18 strains isolated from

表2 方差的主成分提取分析Table2 Variance analysis for major properties of 18 strains isolated from

相关矩阵的特征值提取因子载荷的平方和成分各成分特各成分方差累计百分各因子特各因子的累计贡献征值百分比/%比/%征值贡献率/%率/% 11.96649.15949.1591.96649.15949.159 21.27631.90381.0611.27631.90381.061 30.68917.21498.275 40.0691.725100.000

由表2可知，前两个因子已经可以解释81.06%的方差。利用载荷矩阵与特性向量之间的关系，能够计算出前两个特征向量，由此得到两个主成分具体表达式为：Y1＝0.547X1＋0.952X2＋0.061X3-0.87X4；Y2＝0.512X1＋0.055X2＋0.901X3＋0.4454X4。式中，X1、X2、X3和X4分别为菌株的产酸能力、自溶度、氨肽酶活性和蛋白水解能力。根据主成分分析计算出每个菌株的主成分值，最后利用各特征值的方差贡献率做权重得到18株菌株的综合得分，结果见表3。

表3 18株菌株的综合得分以及排名结果Table3 Comprehensive evaluation and ranking of 18 strains isolated from

表3 18株菌株的综合得分以及排名结果Table3 Comprehensive evaluation and ranking of 18 strains isolated from

菌株编号Y1Y2综合评价排名S-112.1617216.6263513.9191 S-29.95902115.3228112.070215 S-39.88105114.2219511.589639 S-410.0632514.3003311.730967 S-59.94107314.3603511.68058 S-611.6229216.1014213.385662 S-78.05998811.885629.56575816 S-810.4006915.5494512.427244 S-98.90088713.4155610.6778613 S-1011.0833115.3550912.764683 S-1110.2336514.4024311.874486 S-129.48976514.2334611.3568811 S-137.38282711.28078.91702417 S-149.48996113.886811.2205612 S-158.72396612.3370910.1460915 S-165.2600388.6677916.60132918 S-179.70306614.1566711.4560110 S-188.63374613.178110.422414

由表3可知，S-1菌株的综合评价最高，该菌的产酸能力低、自溶度及氨肽酶活性高，蛋白水解能力较高。在一定范围内菌株自溶酶的活性随着环境中干酪的pH值逐渐升高而增大，所以，当干酪体系中酸度较弱时，自溶特性强的菌株快速自溶，释放胞内蛋白酶、氨肽酶等，酶活性较高的菌株快速水解蛋白质，加快干酪促熟。因此，实验选取S-1菌株作为促熟发酵剂。

2.3 16S rDNA基因序列分析

图1 菌株S-1 PCR扩增产物电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of PCR-amplified fragments from strain S-1

图1为菌株S-1的PCR扩增产物电泳图，GenBank登录号为CP002222，Blast比对结果显示，菌株S-1与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ)同源性达到99%。因此，菌株S-1鉴定为植物乳杆菌。

2.4 菌株S-1对可溶性氮含量的影响

pH4.6可溶性氮含量的高低表明蛋白质水解程度的高低，它是干酪成熟程度的一种标志[19]。pH4.6可溶性氮主要分离出小肽和中肽。由图2可知，在成熟过程中添加菌株S-1的实验组与对照组之间pH4.6可溶性氮含量无显著性差异(P＞0.05)，说明菌株S-1对酪蛋白的初级水解作用无影响。

图2 干酪浆成熟过程中pH4.6可溶性氮含量变化Fig.2 Change in pH 4.6 soluble nitrogen content during cheese slurry ripening in the presence of strain S-1

2.5 菌株S-1对 TCA-N可溶性氮含量的影响

12% TCA反映蛋白质降解的深度，可以更好的作为干酪成熟的指标。TCA-N主要分离出小分子肽和游离氨基酸[20]。由图3可知，在成熟过程中添加菌株S-1的实验组TCA-N浓度高于对照组(P＜0.05)，表明菌株S-1在成熟过程中自溶裂解释放的胞内肽酶加速了体系中小肽和游离氨基酸的产生，对干酪的促熟起到一定作用。

图3 干酪浆成熟过程中12%TCA-N含量变化Fig.3 Change in TCA-N content during cheese slurry ripening in the presence of strain S-1

3 结 论

从中国传统发酵食品酸菜中筛选出一株非发酵剂乳酸菌菌株S-1，经16S rDNA基因序列分析鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ)，该菌株能够在干酪成熟环境中生长，其产酸能力低、自溶度以及氨肽酶活性较高；在干酪浆模型中水解蛋白能力较强，适宜作为优良的促熟发酵剂。

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Isolation of a Strain of Non-starter Lactic Acid Bacteria Accelerating Cheese Ripening and Its Effect on Cheddar Cheese Slurry Proteolysis

ZHOU Rui，LI Xiao-dong*，PAN Chao
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

A strain of non-starter lactic acid bacteria capable of accelerating cheese ripening were screened and isolated and its effect on cheddar cheese slurry proteolysis during ripening was also explored. Rogosa agar medium was used for primary strain isolation from Chinese northeastern traditional fermented food, and the isolates obtained were screened further by multivariate statistical analysis. Strain identification was conducted by 16S rDNA gene sequencing and Blast searches against the public database. The results showed that a non-starter lactic acid bacterium was successfully isolated and named as S-1. The strain was identified as Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III. Moreover, the strain displayed high aminopeptidase activity and autolytic capacity although it had low acid-producing capacity. Furthermore, the strain revealed high proteolytic capacity during cheese slurry ripening.

cheese；ripening-accelerating effect；Suancai；non-starter lactic acid bacteria；screening；identification；proteolysis

TS252.53；TS201.3

A

1002-6630(2012)01-0131-05

2011-02-16

2010年度教育部“长江学者和创新团队发展计划”资助项目(IRT0959)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAD09B00)

周蕊(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为乳品科学与技术。E-mail：emmazhou1985@163.com

*通信作者：李晓东(1968—)，男，教授，博士，研究方向为乳品科学与技术。E-mail：hrblxd@163.com