酸性半纤维素降解细菌的筛选与鉴定

2012-01-12徐有权顾文杰张发宝徐培智解开治王立群

微生物学杂志 2012年2期

徐有权，顾文杰，张发宝，徐培智，解开治，王立群*

(1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030;2.广东省农业科学院土壤肥料研究所，广东广州510640)

农作物秸秆是自然界中蕴藏十分丰富的可再生资源，我国每年秸秆产量可达7亿多吨［1］。近些年来，科学家们不断探索有效利用秸秆废弃物的方式。其中，将秸秆还田或用于堆制肥料，不但充分利用了资源、减少了污染，还能增加土壤有机质，使土壤肥力提高，利于作物生长，因此备受关注。但秸秆直接还田后在土壤中分解转化的周期长，难以作为当季作物的肥源。而制约秸秆分解的关键问题是由于秸秆含有大量难以分解的木质素、纤维素和半纤维素，其中半纤维素占植物干重的35%［2］，在自然界中含量仅次于纤维素。半纤维素通过化学键与木质素连接，包裹在纤维之外，将木质素和纤维素紧紧拉在一起，形成难分解的木质纤维素［3］。半纤维素的快速分解是整个秸秆分解进程中至关重要的环节，但目前研究的热点主要集中在纤维素和木质素降解菌的筛选［4］，而对半纤维素降解菌研究却较少。本试验筛选出高效半纤维素降解土著微生物，保证其在土壤中具有较好的定植能力，并且能够适应我国南方酸性土壤环境，产酶能力稳定。对所筛菌株进行了鉴定以确保菌株的安全性，为半纤维素降解菌在今后的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品采自广东省增城市周边水稻土及田间富含腐烂稻秆的泥土。

1.1.2 培养基(g/L)初筛培养基:NH4NO32.0，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl2·2H2O 0.2，K2SO40.1，NaCl 0.2，半纤维素15.0，琼脂20.0，pH 5.0～6.0，121℃灭菌20 min;牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂20.0，pH 5.0～6.0，121℃灭菌20 min，用于菌种的纯化保藏;复筛培养基:K2HPO41.0，KH2PO41.0，NH4NO32.0，MgSO4·7H2O 0.2，酵母膏5.0，半纤维素20.0，pH 5.0～6.0，121℃灭菌20 min，倒双层平板，下层为2%水琼脂;液体发酵培养基:成分同复筛培养基，去除琼脂即可。

1.1.3 主要仪器与试剂冷冻恒温振荡器(太仓市实验设备厂);台式高速冷冻离心机(Sigma);电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);7200型可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);人工气候箱(宁波江南仪器厂);PCR仪(BIO-RAD);凝胶成像仪(BIO-RAD)。Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR和16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit购自TaKaRa公司。Tris，Na2EDTA·2H2O，琼脂糖及其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 半纤维素的制备将脱粒后的稻秆烘干，粉碎后加5倍体积水浸泡，135℃蒸煮0.5 h预处理，洗去灰分并破坏半纤维素-木质素复合结构［5］。过滤得滤渣，加10%NaOH(固液比为1 g∶15 mL)90℃处理2 h。冷却后离心得滤液，用浓盐酸调pH 4.5～5.0。加入与滤液等体积的95%乙醇沉淀半纤维素，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤2次，60℃烘干，研磨后过80目筛［6］。

1.2.2 菌种的初筛称取10 g样品加入含90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，200 r/min振荡30 min后逐级稀释，取稀释度为104～106倍样品0.1 mL涂布初筛培养基平板，30℃恒温箱中倒置培养。挑取初筛平板上具有水解圈的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上分离、纯化。

1.2.3 菌种的复筛将初筛菌株点种于复筛培养基平板，每株点3个重复，以未点菌平板为对照，30℃培养，72 h后测量水解圈的直径D(mm)及菌落的直径d(mm)，并计算D/d值。将复筛菌株在牛肉膏蛋白胨斜面上连续传代7次(每代间隔7 d)，测量各代水解圈直径D与菌落直径d，选择D/d无明显变化的菌株接入液体发酵培养基测定半纤维素酶活力。

1.2.4 半纤维素酶活力测定刮取斜面菌种接入液体牛肉膏蛋白胨培养基，30℃、180 r/min振荡培养24 h，转接种子于含100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，接种量5%，同样条件下发酵培养。发酵液经离心(5 000 r/min，10 min)、过滤后液体即为待测酶液。移取酶液0.5 mL于20 mL刻度试管，加入pH 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0 mL和1%半纤维素底物0.5 mL，50℃水浴中保温10 min，取出立即按DNS法测定还原糖含量，以煮沸酶液为对照［2］。半纤维素酶活力(U/mL):在1 min内水解半纤维素底物，产生1 μg木糖的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活的计算公式如下:

X:半纤维素酶活力，U/mL;A:根据吸光度在标准曲线上查得的木糖生成量，μg;N:样品的稀释倍数;0.5:参与反应的酶量，mL;10:反应时间，min。

1.2.5 菌种鉴定①培养特征及生理生化试验参照伯杰氏手册和常见细菌系统鉴定手册［7-8］;②

16S rDNA序列测定与系统发育分析［9］:平板划线得到待测菌单菌落，用灭菌枪头挑取适量菌体，置于含有50 μL裂解液的灭菌EP管中。80℃热变性15 min，低速离心，取5 μL上清液做为PCR反应模板。用试剂盒扩增基因组DNA。50 μL反应体系:模板DNA 5 μL，PCR Premix 25 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer2 0.5 μL，dH2O补足至50 μL。PCR反应条件:94℃5 min;94℃1 min，50℃1 min，72℃2 min，30个循环;72℃5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物纯化及测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。将测序结果提交至NCBI核酸数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行序列比对，获得相关序列，利用ClustalX(Version 2.1)软件进行多序列匹配排列，以MEGA5.05软件计算进化距离，用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

培养2 d即可在初筛平板上看到菌落，并且部分菌落周围有水解圈出现。随着菌体的生长，一些开始没有产生水解圈的菌落周围也出现水解圈，通过初筛共有16株细菌可在以半纤维素为唯一碳源的初筛培养基上产生水解圈，命名为NB1～NB16。将它们点接到复筛培养基，结果表明:16株菌产生水解圈的早晚、大小及清晰度各不相同。NB13和NB16点种未产生水解圈，NB14和NB15水解圈微弱无法测量，点种结果详见表1。对复筛菌种进行传代，淘汰不再生长和生长缓慢的菌株，最终选择D/d值无明显变化且比值较高的4株菌测定酶活。

表1 水解圈测定结果Table 1 The diameter of hydrolyzed circle of different strains

2.2 半纤维素酶活力测定

所筛菌株的半纤维素酶活测定结果见图1。由图1可知，各菌株除NB6只有在第168 h酶活略有升高外，其余菌株均出现2个高峰。NB9在第48 h达到1个小高峰，酶活为51.12 U/mL;NB8和NB10第1个峰值分别在第72 h和第96 h，酶活为85.12 U/mL和84.57 U/mL。各菌株的第2个产酶高峰均为第168 h，其中NB8的酶活为105.73 U/mL，明显高于其他菌株，差异极显著(P＜0.01)。因此，从产酶时间和酶活两方面综合考虑，最终确定菌株NB8为进一步研究对象。

图1 半纤维素酶活力变化曲线Fig.1 Activition curve of hemicellulase

2.3 菌种鉴定

2.3.1 培养及形态学特征菌株NB8在液体培养基表面形成网状菌膜。在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落形态为乳白色不透明、圆形凸起、边缘整齐、表面褶皱、较湿润。染色结果为革兰阳性、杆状、端生或侧生鞭毛1至数根、无荚膜。

2.3.2 生理生化测定结果菌株NB8的主要生理生化指标见表2。

表2 生理生化实验结果Table 2 The physiological and biochemical characteristics

根据测得结果查阅菌种鉴定手册，结合以上培养及形态特征可以判断该菌与芽胞杆菌属最为相近。

2.3.3 16S rDNA序列分析PCR产物测序后得到1 495 bp大小碱基序列。将测得序列提交至NCBI网站进行序列比对(收录号:JQ038150)，与NB8同源性较高的均为芽胞杆菌属，选取典型菌株，用ClustalX软件进行多序列匹配，以MEGA 5.05软件计算进化距离并构建系统发育树(图2)。从图中可以看到NB8与Bacillus pumilus聚于同一分支，亲缘关系最近。综合以上形态及生理生化特征，可以初步确定NB8为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)。

图2 菌株NB8的16S rDNA序列系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain NB8

3 讨论

从特定环境中筛选到的菌株，往往具有适合在这种环境中生存的能力。从水稻田及周边腐烂稻秆中筛选的菌株，来源于田间，理论上认为它们更适合作为发酵菌剂用于秸秆还田。

在菌株筛选中，有些菌株虽然初筛时水解圈较大或D/d值较高，然而经过传代后却表现出不同程度的退化。D/d值最大的NB7在连续传代后几乎不再生长，NB1、NB2和NB3也出现相同现象。而后将降解效果较稳定的菌株进行酶活测定，从产酶时间及酶活高低等方面综合考虑，NB8效果最好，但NB8在复筛培养基上测得的D/d值却并非最高。这说明，对于高效半纤维素降解菌的筛选要综合水解圈大小、D/d值、传代稳定性、产酶时间以及酶活力等多方面的数据进行考虑。

从酶活测定结果可以看出，216 h里出现2次产酶高峰，这与孙迅等［6］研究结果相似。并且第2次酶活明显高于第1次，总体呈上升趋势。分析其原因，一方面半纤维素酶为诱导酶，在本实验中可能诱导产生了2种主要半纤维素酶组分，一种酶先作用于半纤维素高级结构，暴露出部分亚基后诱导另一种酶的合成。另一方面，可能与菌株的产酶周期有关，在底物诱导下产生相应的酶分解底物生成小分子的产物，产物积累到一定量后反过来抑制酶的合成，关于酶的产生及作用机制的研究还有待进一步深入。

本试验中筛选的菌株经生理生化和分子生物学方法鉴定为短小芽胞杆菌，该菌种可用于农业生产中，安全可靠，72 h半纤维素酶活可达85.12 U/mL，这要高于孙迅等［6］在pH 6.5～8.5筛得短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)H-101半纤维素酶活(47.20 U/mL)和秦玉花［5］筛选的短小芽胞杆菌(B.pumilus)L2-19木聚糖酶活(1.68 U/mL)。慕娟等［10］筛选的短小芽胞杆菌(B.pumilus)M-26木聚糖酶最适作用pH为8.0，酶活为620 IU/mL。以上所筛选得到的芽胞杆菌均在中性偏碱条件下产酶活性较高。而本试验是在pH 5.0～6.0条件下筛选半纤维素分解菌，与同样是酸性条件下筛选的菌株相比也具有较高的酶活力。秦玉花［5］筛选的枯草芽胞杆菌(B.sublitis)Y25最适反应pH为6.0，酶活为1.87 U/mL。陈丛瑾［11］分离的1株木聚糖酶产生菌，初始pH为5.0时，木聚糖酶活为13.68 U/mL。

本试验筛选的具有高效降解半纤维素能力的细菌，其在酸性环境中生长状态良好，酶活较高，

后续应对其产酶条件进一步研究，寻找其最适的产酶条件，进一步提高其产酶能力。另外，半纤维素降解菌降解半纤维素的能力不能简单通过实验室测定D/d值和酶活加以反映，而是需要结合对秸秆的实际降解效果来综合评定。

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