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双歧杆菌丝状体生长形态初探

2012-01-12刘艳霞刘蕾刘俊康邓渝

微生物学杂志 2012年2期
关键词:丝状菌体纸片

刘艳霞,刘蕾,刘俊康,邓渝

(第三军医大学医学检验系生物波研究中心,重庆400038)

细菌在不同环境条件下,生长形态和增殖方式可能发生改变,这是细菌对抗不利环境的一种适应性变化形式。国内学者在这方面做过大量研究,贾继辉等[1]研究报道幽门螺杆菌在抗生素、酸性环境等不利条件下会出现丝状体生长形态;大肠埃希菌在体外抗生素后效应期间菌体显著延长,呈丝状体[2];王丽平等[3]将多种抗生素体外作用于大肠埃希菌,观察发现氨苄西林和阿莫西林以不同浓度作用大肠埃希菌后,可使菌体产生丝状体,2种药使菌体发生丝状变化的程度不一,尤以氨苄西林更甚,而庆大霉素和阿米卡星作用大肠埃希菌后,菌体形态未发生变化,但菌量明显下降。前人研究多集中在抗生素对致病微生物形态的影响方面,对双歧杆菌在特殊环境下生长形态和增殖方式变化的研究报道较少。双歧杆菌作为肠道正常菌群的重要组成,可发挥稳定正常菌群、抗条件致病菌、抗肿瘤、合成维生素、增强机体免疫力、减少医院感染发生等多方面效应[4],是保护肠道的生物屏障之一,研究其生长和增殖状态对维护机体健康具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis),本实验室保存。

1.1.2 培养基改良BS培养基,参考文献[5]方法配置。

1.1.3 试剂维生素E烟酸酯胶囊(北京赛科药业有限责任公司,产品批号:0705009);维生素B6片(湖北华中药业有限公司,产品批号:20071204)。

1.1.4 仪器Olympus多功能显微镜(BX41);原子力显微镜(SPI3800N-SPA400)。

1.2 方法

1.2.1 药敏纸片制备无菌生理盐水将维生素B6片配制成浓度1 mg/mL和10 mg/mL的溶液,分别取5 μL滴加在直径5 mm的药敏实验专用纸片上制备成药敏纸片A和B备用。无菌生理盐水将维生素E烟酸酯胶囊配制成100 mg/mL溶液,取5 μL滴加在直径5 mm的药敏实验专用纸片上制备成药敏纸片C备用。

1.2.2 细菌培养将青春双歧杆菌制成浓度为1×104/mL的细菌悬液,取50 μL均匀涂布于改良BS培养基平板上,待平板表面略干将药敏纸片A、B和C分别置于3个平板中央,37℃厌氧培养48 h,分别挑取药敏纸片周围单菌落进行革兰染色,观察细菌生长情况。同时,将药敏纸片A、B和C放置在同一平板中边长为3 cm的等边三角形的3个顶点上,37℃厌氧培养48 h,挑取三角形区域内单个菌落革兰染色观察细菌生长情况。再将三角形区域内单个菌落制备成1×104/mL菌悬液,取50 μL转种培养于改良BS培养基平板上,厌氧培养48 h,挑取单个菌落革兰染色观察。取上述双岐杆菌单个菌落连续转种3次于改良BS培养基培养,革兰染色观察细菌生长情况。1.2.3原子力显微镜样本收集与检测方法将待观察的单个菌落样本用无菌生理盐水稀释,制备成200 μL细菌悬液,吸取少量细菌悬液,小心滴于新解离的云母片上,1.5%戊二醛室温固定5 min,再用超纯水漂洗,空气中风干,日本精工SPI3800N-SPA400型原子力显微镜在室温大气环境中对双歧杆菌生长形态进行扫描观测。图像均在轻敲模式(tapping mode)下获得,探针为SIAF01(微悬臂长200 μm,弹性系数0.12 N/m),力常数为0.2 N/m,扫描参数为X:115 μm、Y:115 μm、Z:29.97 μm。

2 结果与分析

2.1 革兰染色观察双歧杆菌生长情况

青春双歧杆菌在改良BS培养基上常规培养的生长增殖正常,细菌形态如图1A所示。在维生素B6药敏纸片A、维生素B6药敏纸片B及维生素E烟酸酯药敏纸片C单独作用的条件下,双歧杆菌生长增殖方式未发生改变。但在维生素B6和维生素E烟酸酯联合作用下,三角形区域内的双歧杆菌菌落出现明显的丝状体生长形态,结果如图1B所示。将三角形区域内单个菌落第1次转种培养于改良BS培养基平板上,厌氧培养48 h后双歧杆菌仍保持丝状体群集生长的现象。连续转种3次后,革兰染色观察到双歧杆菌丝状体生长现象消失,恢复到常规培养时的菌体形态。

图1 双歧杆菌革兰染色结果Fig.1 Gram stain results of Bifidobacterium

2.2 原子力显微镜扫描观察双歧杆菌增殖模式

通过原子力显微镜扫描方法,分别观察了青春双歧杆菌在改良BS培养基上常规培养的生长状态(图2A);在维生素B6和维生素E烟酸酯联合作用下,丝状体生长形态的双歧杆菌二分裂增殖方式受到抑制(图2B)。连续转种3次后,恢复到常规培养时的生长状态。

图2 双歧杆菌原子力显微镜扫描结果Fig.2 Atomic force microscope scan results of Bifidobacterium

3 讨论

近年来,随着益生菌在食品中的应用,菌体稳定性受到重视。Saarela等[6]研究发现,紫外诱导酸敏感的双歧杆菌株B.breve 99发生突变再结合低pH值培养能够增强该菌株对有机酸的耐受性,提高菌株在低pH果汁中的稳定性。Shah等[7]研究维生素和抗氧化剂增强果汁中益生菌稳定性的效果,发现白葡萄籽提取物、绿茶提取物及维生素C能够增强双歧杆菌(HOWARU Bifidobacterium lactis HN001)等3种益生菌在模拟果汁培养体系(初始pH 3.8)中的稳定性,而维生素B2、B3、B6和维生素E单独使用未发现增强菌体稳定性的效果。

上述研究均关注菌体的存活数量,未关注形态变化。本研究中观察到,双歧杆菌在维生素B6和维生素E烟酸酯联合作用下出现丝状体生长形态且二分裂增殖受到抑制,转种1至2次于正常培养基上仍可维持群集生长的特性,转种3次后恢复正常生长形态,丝状体群集生长现象消失,说明外界环境的改变可对双歧杆菌的形态和增殖方式产生较大影响,这种形态和增殖方式上的改变可能导致双歧杆菌活性发生相应变化,从而影响机体肠道微生态环境。课题组前期研究发现,在化疗药物5-氟尿嘧啶作用下,双歧杆菌菌体加长,断裂减少,转变成丝状体,长度在10 μm以上,这些丝状体在正常的生长条件下又可以恢复正常生长,表明化疗药物可以直接影响双歧杆菌的生长,而双歧杆菌对化疗药的作用可产生显著的适应性变化[8],而将双歧杆菌暴露于有氧环境或敏感抗菌药物作用下,亦可生成特殊形态的菌体,这种形态的改变常常伴随有正常的细菌菌体的自溶,一方面可以认为它们是不利环境的产物,另一方面也可以认为它们是对这种不利环境有抵抗力的个体[9],即可能是增加菌体稳定性的途径之一。

随着现代生活节奏的加快及生活方式的改变,环境污染、心理压力、药物滥用等因素都会对人体内环境产生负面影响,并将直接或间接影响肠道重要生理菌群双歧杆菌的生长,这种影响可导致双歧杆菌出现各种适应性的生长和增殖方式,本实验结果为认识双歧杆菌的适应性生长和增殖提供了实验基础。维生素B6和维生素E烟酸酯联合作用下双歧杆菌的生长增殖方式发生变化的具体机制有待进一步研究,这种适应性生长增殖模式的改变对肠道及人体的影响等有关问题尚需进一步探讨。

[1] 贾继辉,张茂修,周亚滨,等.幽门螺杆菌丝状体的形成和回复性的研究[J].山东大学学报(医学版),2004,42(1):1-8.

[2] 朱曼,王睿,张永青,等.加替沙星和环丙沙星体外抗生素后效应期间大肠埃希菌形态学观察及膜电位和膜通透性变化[J].中国临床药理学与治疗学,2005,10(9):1005-1009.

[3] 王丽平,郭永刚,史晓丽,等.不同抗生素对大肠埃希菌形态的影响及其诱导游离内毒素的释放[J].中国兽医学报,2004,24(6):596-599.

[4] Vinderola CG,Medici M,Perdigon G.Relationship between interaction sites in the gut,hydrophobicity,mucosal immunomodulating capacities and wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteria[J].J Appl Microbiol,2004,96(2):230-243.

[5] Wang Z,Xiao G,Yao Y,et al.The role of Bifidobacteria in gut barrier function after thermal injury in rats[J].J Trauma,2006,61(3):650-657.

[6] Saarela M,Alakomi HL,Mättö J,et al.Improving the storage stability of Bifidobacterium breve in low pH fruit juice[J].Int J Food Microbiol,2011,149(1):106-110.

[7] Shah NP,Ding WK,Fallourd MJ,et al.Improving the stability of probiotic bacteria in model fruit juices using vitamins and antioxidants[J].J Food Sci,2010,75(5):M278-82.

[8] 刘俊康,邓渝,吴小兰,等.双歧杆菌在5-氟尿嘧啶作用下的适应性变化[J].世界华人消化杂志,2006,14(32):3139-3142.

[9] 刘俊康,闫国华,邓渝,等.双歧杆菌属潜生体的初步实验研究[J].中华医院感染学杂志,2007,17(5):513-515.

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