微小毛霉凝乳酶的分离纯化研究

高维东，宋礼，纪银莉，何潇，张玉平，甘伯中

(1.甘肃华羚生物技术研究中心，甘肃兰州730000;2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070)

凝乳酶是生产奶酪及凝乳酶干酪素中使牛乳凝固的关键性酶，它是一种天冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是限制性剪切酪蛋白Phe105～Met106之间的肽键，从而导致牛奶的凝结，因此被广泛应用于奶酪制造业和干酪素产业［1］。凝乳酶来源广泛，在动植物以及微生物中都有，传统的凝乳酶来源于小牛的皱胃，但是随着世界奶酪产业的不断壮大，单纯靠宰杀大量的小牛获取凝乳酶显然与现代工业的发展不相符，植物凝乳酶虽然来源广泛，但是其蛋白水解力强，并且受时间、地点等的限制难以发展［2-3］，微生物生长周期短，产量大，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶成本较低，酶提取方便，经济效益高。微生物凝乳酶从1965年起开始取代小牛皱胃酶制造干酪以来，成功地弥补了小牛凝乳酶短缺的问题［4］，并在奶酪制造业与干酪素产业中得到了广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料与试剂微小毛酶HL-1，中国科学院微生物研究所保藏菌株，经本实验室紫外线和亚硝基胍诱变筛选得到;脱脂奶粉，完达山乳制品有限公司;标准分子量蛋白，美国Sigma公司;其他生化试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基①斜面培养基:马铃薯(去皮切块)200 g，葡萄糖20 g，琼脂17.3 g，自来水1 000 mL。将马铃薯去皮切块，加1 000 mL自来水，在电炉上80℃加热1 h，用纱布过滤，补加自来水至1 000 mL，加入葡萄糖和琼脂，加热溶解，分装，121℃高压灭菌20 min待用［5］;②液体种子培养基:麸皮水解液30 mL，硝酸铵0.5 g，蔗糖1 g，磷酸二氢钾0.2 g;③三角瓶发酵培养基:粉碎后新鲜麸皮30 g、硝酸铵0.3 g和磷酸氢二钾0.5 g加入到500 mL三角烧瓶内，按1∶0.8加入自来水，搅拌均匀，在121℃下灭菌25 min待用;④浸提液:0.85%的氯化钠溶液［6-7］。

1.1.3 主要仪器与设备UV2450紫外可见分光光度计，日本SHIMADZU;BIO-RAD垂直板电泳仪，美国BIO-RAD公司;恒温培养箱，上海一恒科技有限公司;高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机有限公司;超净工作台，苏州净化设备有限公司;超滤仪，美国Millipore公司;真空冷冻干燥机，长沙湘仪离心机仪器设备有限公司;纯水机，重庆力德高端水处理设备有限公司;蛋白质层析系统AKTA purifier，美国GE医疗集团公司。

1.2 方法

1.2.1 凝乳酶活力的测定方法Arima方法:用0.01 mol/L的氯化钙液配制10%脱脂奶粉液，此溶液配制后在室温放置40 min以上使用，当天使用有效，不宜冰箱放置［8］。取5 mL 10%的脱脂奶粉液在35℃保温10 min，加0.5 mL适当稀释的酶液(35℃保温)，立即摇匀，开始计时(凝乳时间控制在40～90 s)，并把试管倾斜45°以上。在水浴中震荡试管，观察壁上出现小颗粒为终点，记录凝乳时间。在上述条件下，40 min凝1 mL 10%脱脂奶粉的酶量定义为一个Soxhlet单位(SU)［9］。

式中:2 400为40 min的凝乳时间，s;D为酶液稀释倍数;t为反应时间。

1.2.2 凝乳酶制剂的制备方法将配置好的发酵培养基按14%接种，28℃下发酵72 h后待用。

1.2.3 浸提温度对酶提取的影响分别在20、25、30、35、40、45℃下将发酵完全的培养基加入0.85%氯化钠溶液里浸提12 h，除去固体物后测定凝乳酶活力。每个样做3个平行试验，取平均值做结果分析。

1.2.4 浸提时间对酶提取的影响30℃下在浸提罐中加入0.85%氯化钠溶液，分别浸提2、4、6、8、10、12、14 h，除去固形物测定凝乳酶的活力。每个样做3个平行试验，取平均值做结果分析。

1.2.5 浸提液pH对酶提取的影响将0.85%氯化钠溶液的pH分别调整为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在不同pH条件下浸提培养物10 h，除去固形物测定凝乳酶活力。每个样做3个平行试验，取平均值做结果分析。

1.2.6 浸提液离子强度对酶提取的影响调整浸提液氯化钠的浓度，分别配制浓度为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的氯化钠浸提液，浸提10 h，除去固形物测定凝乳酶活力。每个样做3个平行试验，取平均值做结果分析。

1.2.7 浸提液加入比例对酶提取的影响分别按物料与浸提液质量比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7加入浸提液，在30℃下提取10 h，除去固形物测定凝乳酶活力。每个样做3个平行试验，取平均值做结果分析。

1.2.8 离心沉降对酶活力的影响浸提物以200目的滤布除去固形物，得到的粗酶液分别在6 000、8 000、10 000、12 000、14 000 r/min下离心10 min，测定离心后的上清液凝乳酶活力。每个样做3个平行试验，取平均值做结果分析。

1.2.9 膜法对凝乳酶的纯化离心后的粗酶液利用微滤及浓缩技术，经过1 μm熔喷滤芯、1 μm PP折叠滤芯、0.2 μm PES折叠滤芯、0.45 μm PES折叠滤芯和0.45 μm PP折叠滤芯等5步过滤，除去发酵液中的培养基杂质、菌丝体、菌体和部分大分子杂蛋白，实现了酶液的澄清，再经过8 000分子量的超滤膜除去大量的水分，实现酶液的浓缩，测定酶活。

1.2.10 有机溶剂沉淀法对凝乳酶的纯化离心后的粗酶液加乙醇(95%)，其比值为1∶0.6(体积比)，静置4 h，离心取上清液加乙醇(95%)，其比值为1∶0.8(体积比)，静置过夜，离心，沉淀用10倍体积pH 5.0的0.05 mol/L醋酸缓冲液溶解，测定酶活。

1.2.11 层析法对凝乳酶的纯化利用美国通用医疗集团的AKTAprocess蛋白质层析仪，用S300和G100的填料进行微小毛霉凝乳酶蛋白的分离纯化，实现了凝乳酶蛋白的自动化分离纯化，分部收集，测定收集液酶活。

2 结果与分析

2.1 浸提温度对酶提取的影响

由图1可以看出，30℃浸提活力最高，酶活为5 450 U/mL。温度过低，不利于酶从菌丝体及培养物基质中释放出来，温度过高会对酶蛋白的热稳定性造成影响，同时易被微生物降解利用。

图1 浸提温度对酶提取的影响Fig.1 Effects of reaction temperature on enzyme extraction

2.2 浸提时间对酶提取的影响

由图2可以看出，浸提10 h，浸提液凝乳酶活力较高，酶活为4 870 U/mL。随着浸提时间的延长，凝乳酶逐渐释放到浸提液中，但由于酶蛋白的稳定性及微生物的降解作用，活力从10 h后逐渐降低。

图2 浸提时间对酶提取的影响Fig.2 Effects of time on enzyme extraction

2.3 浸提液pH对酶提取的影响

由图3可以看出，当浸提液的pH值在6.5时，凝乳酶有较高的回收率，酶活为4 120 U/mL。微小毛酶凝乳酶的最适pH值为5.8左右，所以在酸性条件下浸提，更有利于微小毛霉凝乳酶的释放。

图3 浸提液pH值对酶提取的影响Fig.3 Effects of pH on the enzyme extraction

2.4 浸提液离子强度对酶提取的影响

由图4可以看出，1%的氯化钠有利于凝乳酶的提取，酶活为5 570 U/mL。当氯化钠浓度过高或过低时，会偏离菌丝体的等渗点，阻碍凝乳酶的释放。

2.5 浸提液加入比例对酶提取的影响

由图5可以看出，1∶5的固液比有利于凝乳酶的提取，酶活为4 730 U/mL。固液比太低，不利于凝乳酶从菌丝体及基质中释放;固液比过高，酶浓度会降低造成酶活的降低，同时间接对后期酶的提取浓缩增加生产成本。

图4 浸提液离子强度对酶提取的影响Fig.4 Effects of ion concentration on the enzyme extraction

图5 固液比对酶提取的影响Fig.5 Effects of Solid-liquid ratio on the enzyme extraction

2.6 离心力对酶活力的影响

图6 离心力对酶提取的影响Fig.6 Effects of Centrifugal force on the enzyme extraction

由图6可以看出，10 000 r/min离心10 min凝乳酶的回收率最高，酶活为5 720 U/mL。离心力较低，杂质及杂蛋白去除不完全，酶活较低。离心力过高，会造成部分酶蛋白的沉淀及损伤，酶活也不高。

2.7 膜法对凝乳酶的纯化

经过5次过滤，1次浓缩后，凝乳酶样品浓缩8倍，活力提高约6倍，酶活为34 227 U/mL。由于除去了部分杂蛋白、小分子糖类、无机盐及水，酶液酶活极大提高，但酶液通过滤芯和滤膜时，酶蛋白会有部分损伤，酶活提高倍数和浓缩倍数无明显的对应关系。同时试验中也发现浓缩倍数越高，酶蛋白损伤也就越大。试验中减少膜超滤时间，降低浓缩倍数，采用5倍浓缩粗酶液，酶活约提高了4.5倍，酶活为25 765 U/mL。

2.8 有机溶剂沉淀法对凝乳酶的纯化

经过有机溶剂浸提后，样品浓缩50倍，活力提高约17倍，酶活为97 543 U/mL。通过沉淀法得到凝乳酶溶液，浓缩倍数及酶活比膜过滤法纯化凝乳酶都有所提高，但从浓缩倍数及活力提高倍数对应关系可以看到，有机溶剂沉淀法对酶活损失也较大。由于有机溶剂的使用量大，在后期工业化应用中，有机溶剂的回收及安全使用必成为工业化推广着重考虑的问题。

2.9 层析法对凝乳酶的分离提纯

图7 层析法对凝乳酶的分离提纯Fig.7 Chromatography for separation and purification of chymosin

利用AKTAprocess蛋白质层析仪层析样品后，由图7可以看出，凝乳酶的保留时间在110～130 min之间，分离纯化后，凝乳酶蛋白纯度达到95%以上，收集酶液酶活为52 786 U/mL。利用层析法获得了较纯的凝乳酶，粗酶液浓缩了15倍，凝乳酶酶活提高约10倍，酶活损失最小。与膜法对凝乳酶纯化相比，层析对凝乳酶的纯化效果较好，但层析处理量小，填料昂贵，不适合工业化推广。

3 讨论

试验结果表明微小毛霉(HL-1)凝乳酶的最适提取条件:浸提温度30℃;浸提液pH 6.5;浸提时间10 h;浸提液氯化钠浓度1%;物料与浸提液比例为1∶5;在10 000 r/min下离心10 min，粗酶液提取效果最好。95%的乙醇沉淀纯化凝乳酶，浓缩倍数及酶活提高倍数较好，但工业化推广中乙醇的安全使用及回收成本较高。层析纯化凝乳酶，酶活损失最小，纯化效果最好，但填料昂贵，处理量小，不适合工业化推广。膜法纯化凝乳酶，通过控制膜处理时间，降低浓缩倍数，酶活损失可以降到最小，适合工业化推广。

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［2］ 周俊清，林亲录.微生物源凝乳酶的研究进展［J］.中国食品添加剂，2004，2(4):6-9.

［3］ 姜峰，张兰威.我国凝乳酶特性及其替代品的研究现状［J］.食品研究与开发，2003，24(6):3-6.

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［9］ Arima K，Yu J，Iwasaki S.Milk-clotting enzyme from Mucor Pussilus［J］.In methods in enzymology Academic，1970，19(3):446-460.