毛霉高产中性蛋白酶发酵培养基的优化

刘莹莹，刘 颖，张 光，孙冰玉，王金凤，石彦国

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

毛霉高产中性蛋白酶发酵培养基的优化

刘莹莹，刘 颖，张 光，孙冰玉，王金凤，石彦国*

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

以雅致放射毛霉和五通桥毛霉为实验材料，采用单因素和正交优化实验对两种毛霉高产中性蛋白酶发酵培养基进行优化。结果表明：雅致放射毛霉产中性蛋白酶发酵培养基最佳成分为：蔗糖添加量为10%、黄豆粉添加量为2.5%、KH2PO4添加量为0.4%、CaCl2添加量为0.11%，此条件下中性蛋白酶酶活力达1310.56U/mL；五通桥毛霉产中性蛋白酶发酵培养基最佳成分为：蔗糖添加量为10%、黄豆粉添加量为3.0%、KH2PO4添加量为0.37%、CaCl2添加量为0.07%，此条件下中性蛋白酶酶活力达1306.38U/mL。两种毛霉酶活力提高的百分比分别为60.1%和46.7%，此研究成果为缩短腐乳后酵周期及直装腐乳发酵工艺的后续研究奠定了基础。

发酵培养基，毛霉，中性蛋白酶酶活力

腐乳是我国具有民族特色的传统大豆发酵制品，在世界饮食文化之林中有着特殊的地位。其口味鲜美、风味独特、营养丰富，是深受大众喜爱的佐餐食品，被称为“东方奶酪”[1]。酿造腐乳包括一系列的物理化学和生物化学过程，大豆浸泡、磨浆、点浆、压榨成型制成豆腐的工序属于物理化学过程，豆腐前发酵培菌和加辅料后发酵等主要属于生物化学过程，每一道工序都会影响其品质[2]。在腐乳生产过程中有多种微生物和酶参与，其共同作用造就了腐乳的独特风味、营养和一些特殊的保健功能[3-4]。腐乳发酵阶段是微生物发挥作用的主要阶段，发酵阶段可分为前期培菌和后期发酵。前期培菌是在半开放条件下培养微生物的酶系；后期发酵主要是酶系与微生物协同参与生化反应的过程[5-7]。因此，腐乳的生产离不开微生物。常用于生产腐乳的微生物有毛霉、根霉、米曲霉、酵母菌、红曲霉及细菌等，其中，毛霉产蛋白酶种类较多、产酶能力较强。本研究以腐乳生产常用的雅致放射毛霉和五通桥毛霉为实验菌株，通过对发酵培养基进行优化，提高毛霉产中性蛋白酶的酶活力，从而缩短腐乳发酵周期、解决腐乳生产受季节限制的问题，提高腐乳的生产效率、满足市场需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）菌种编号3118、五通桥毛酶（Wutungkiao Mucor）菌种编号40477 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；氯化钙、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、碳酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、蔗糖 分析纯，西陇化工股份有限公司；三氯乙酸 分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司；黄豆粉、豆坯 哈尔滨珍味粮油冷冻产品商贸集团公司；可溶性淀粉、葡萄糖 分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；硫酸镁 分析纯，天津博迪化工股份有限公司；乳糖、麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、酪蛋白、福林酚 分析纯，北京奥博星生物技术有限公司。

80-2B型台式低速离心机 湖南星科科学仪器有限公司；722E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器 浙江新丰医疗器械有限公司；无菌操作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；SY-2-4型电热式恒温水浴锅 天津欧诺仪器仪表有限公司；电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶液制备 取出于28℃、pH6.0条件下，发酵60h的毛霉发酵液于80目的网筛过滤去菌丝，之后将滤液在4000r/min下离心20min；取1.0mL滤液于100.0mL容量瓶中，用磷酸缓冲溶液定容至100.0mL，即制得稀释酶液[8-9]。

1.2.2 中性蛋白酶酶活测定方法 按照国家标准（GB/T23527-2009），采用Folin-酚法测定中性蛋白酶活力[10]。

1.2.3 毛霉产中性蛋白酶发酵培养基的优化

1.2.3.1 碳源种类及浓度对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响 在发酵培养基中，分别添加10%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉五种碳源，以10%大米粉作参照，并加入2%的豆坯、0.5%的NaCl配制培养基。每500mL三角瓶装液量150mL，调节pH6.0，0.1MPa、121℃灭菌30min[11]。冷却后接入孢子数为×106、2%的毛霉孢子悬液，于28℃下培养60h，充分发酵后制成粗酶液，测定中性蛋白酶酶活力，确定最佳碳源种类。

根据上述实验结果，分别添加8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%的蔗糖作为碳源，在相同条件下，测定毛霉产中性蛋白酶酶活力，确定碳源最适添加比例。

1.2.3.2 氮源种类及浓度对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响 在发酵培养基中，分别添加浓度为2%酵母膏、黄豆粉、豆坯、硫酸铵四种氮源，以2%蛋白胨为参照，并加入10%的蔗糖（五通桥毛霉为8%）、0.5%的NaCl配制培养基，其他条件与1.2.3.1相同，测定毛霉产中性蛋白酶酶活力，确定毛霉产中性蛋白酶最佳氮源种类。

根据上述实验结果，分别添加1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%比例的黄豆粉作为氮源，在相同条件下，充分发酵后制成粗酶液，测定毛霉产中性蛋白酶酶活力，确定氮源最适添加比例。

1.2.3.3 无机盐种类及浓度对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响 由于无机盐种类及添加量对毛霉菌发酵产酶影响很大，故本实验以相关的研究资料及参考文献[12-14]为依据，分别在毛霉发酵培养基中添加四种无机盐成分，MgSO40.04%、NaCl 0.5%、KH2PO40.4%、CaCl20.1%，以空白作参照，并加入10%的蔗糖（五通桥毛霉为8%）、3%的黄豆粉，其他条件与1.2.3.1相同，充分发酵后制成粗酶液，测定毛霉产中性蛋白酶酶活力，确定最佳无机盐种类及浓度。

根据上述实验结果，KH2PO4的添加量分别为0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%；CaCl2的添加量分别为0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%。同时添加其他辅料配制培养基，同样根据蛋白酶活力确定两种无机盐的最适添加浓度。

1.2.3.4 毛霉产中性蛋白酶发酵培养基的正交优化根据上述单因素实验，以蔗糖添加量、黄豆粉添加量、KH2PO4、CaCl2为四个影响因素，采用正交实验设计L9（34）安排实验，以毛霉产中性蛋白酶酶活为指标，进行正交优化实验，因素水平表见下表1和表2。

表1 雅致放射毛霉发酵培养基正交优化因素水平表Table.1 Orthogonal factors level for optimization of fermentation medium of Actinomucor elegans

表2 五通桥毛霉发酵培养基正交优化因素水平表Table.2 Orthogonal factors level for optimization of fermentation medium of Wutungkiao Mucor

1.3 数据处理

本实验采用单因素及无空列正交实验，每组实验做三次平行实验，研究了几个影响因素对毛霉产中性蛋白酶的影响，并使用SPSS17.0统计软件对实验所得数据进行统计分析，最后通过极差分析得出各个影响因素的显著性。

2 结果与分析

2.1 碳源种类及浓度对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响

由图1可知，本实验所使用的几种碳源，均可被两种毛霉利用产生蛋白酶。蔗糖和葡萄糖对于蛋白酶的合成有较好的促进作用，其中蔗糖对于蛋白酶合成的诱导作用要显著优于其他碳源（p＜0.05），两种毛霉菌产蛋白酶酶活分别达1227.68、1196.19U/mL。葡萄糖有利于毛霉菌丝体的生长，但对于蛋白酶合成的诱导作用无蔗糖明显（p＜0.05）。故将蔗糖选为毛霉发酵培养基的最佳碳源。

由图2可知，随着蔗糖的加入，两种毛霉菌的产蛋白酶酶活均有所升高；在蔗糖浓度在8%～9%之间时，蛋白酶酶活上升较显著（p＜0.05）；当蔗糖浓度达到10%时，蛋白酶酶活也达到最大值1242.05U/mL和1208.74U/mL；但此后，随着蔗糖浓度继续升高时，蛋白酶酶活开始下降，可能是由于过多的蔗糖利于菌丝体的大量生长繁殖而抑制了蛋白酶的生成。故毛霉发酵培养基的碳源浓度选为10%。

图1 碳源种类对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响Fig.1 The influence of carbon source species on neutral protease activity of mucor

图2 碳源浓度对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响Fig.2 The influence of carbon source concentration on neutral protease activity of mucor

2.2 氮源种类及浓度对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响

由图3可知，本实验所提供的几种氮源，均可被两种毛霉利用产生蛋白酶。其中黄豆粉的促进作用较明显（p＜0.05），雅致放射毛霉和五通桥毛霉蛋白酶酶活分别达1245.42、1230.28U/mL，而其他几种氮源虽可被毛霉利用，但对于蛋白酶合成的诱导作用没有有利的影响（除酵母膏外），蛋白酶酶活没有基础培养基的酶活高。故将黄豆粉选为毛霉发酵培养基的最佳氮源。

图3 氮源种类对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响Fig.3 The influence of nitrogen source species on neutral protease activity of mucor

图4 氮源浓度对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响Fig.4 The influence of nitrogen source concentration on neutral protease activity of mucor

由图4可知，随着黄豆粉的加入，两种毛霉菌的产蛋白酶酶活均有所升高；在黄豆粉添加量在1%～2%之间时，蛋白酶酶活上升较显著（p＜0.05）；随后，蛋白酶酶活上升较缓慢，但仍呈上升趋势；当黄豆粉添加量在3%时，蛋白酶酶活达到最大值1260.38、1245.37U/mL，故毛霉发酵培养基的氮源添加量选为3%。

2.3 无机盐种类及浓度对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响

由图5可知，MgSO4、KH2PO4和CaCl2相对于NaCl而言，在提高蛋白酶酶活的影响较显著（p＜0.05）。添加MgSO4、KH2PO4和CaCl2的培养基中，雅致放射毛霉的蛋白酶酶活力分别达到了1270.46、1287.36、1280.32U/mL；五通桥毛霉蛋白酶酶活力分别达到了1260.16、1270.15、1272.76U/mL；磷酸盐在发酵液中起到了缓冲体系pH的作用，对保持产酶环境的稳定，同时也同MgSO4和CaCl2一起起到了诱导毛霉产蛋白酶的作用[15]。综上所述，在优化毛霉蛋白酶发酵培养基优化方案中的无机盐选择为MgSO4、KH2PO4和CaCl2。因为MgSO4的添加量0.04%很小，故对另两种无机盐设置浓度梯度实验。

图5 无机盐种类对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响Fig.5 The influence of inorganic salt species on neutral protease activity of mucor

由图6可知，随着KH2PO4的加入，两种毛霉菌的产蛋白酶酶活均有所升高。雅致放射毛霉在KH2PO4添加量在0.3%～0.35%之间时，蛋白酶酶活上升较显著（p＜0.05）；当KH2PO4添加量超过0.40%时，蛋白酶酶活出现下降趋势，即当KH2PO4浓度为0.40%时，蛋白酶酶活达到最大值1283.53U/mL；对于五通桥毛霉，当KH2PO4浓度为0.35%时，五通桥蛋白酶酶活达到最大值1282.58U/mL，故KH2PO4的最佳浓度分别选为0.40%和0.35%。

图6 KH2PO4浓度对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响Fig.6 The influence of KH2PO4concentration on neutral protease activity of mucor

由图7可知，随着CaCl2的加入，两种毛霉菌的产蛋白酶酶活均有所升高。对于雅致放射毛霉，CaCl2添加量在0.06%～0.1%之间时，蛋白酶酶活上升；当CaCl2添加量超过0.1%时，蛋白酶酶活下降；当CaCl2浓度为0.1%时，雅致放射毛霉蛋白酶酶活达到最大值1288.05U/mL。而CaCl2浓度为0.08%时，五通桥毛霉蛋白酶酶活达到最大值1286.02U/mL。综上，两种毛霉发酵培养基的最佳CaCl2浓度分别选为0.1%和0.08%。

图7 CaCl2浓度对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响Fig.7 The influence of CaCl2concentration on neutral protease activity of mucor

2.4 培养基正交优化

2.4.1 雅致放射毛霉发酵培养基正交优化的结果与分析 在单因素实验的基础上，以A：蔗糖、B：黄豆粉、C：KH2PO4、D：CaCl2的添加量为四个因素进行正交实验设计，以毛霉产中性蛋白酶酶活力作为评价指标。选用L9（34）正交表对雅致放射毛霉发酵培养基的最佳参数进行优选，采用SPSS17.0进行分析，结果见表3。

由表3中实验结果及极差RB＞RC＞RD＞RA可知，四个因素对雅致放射毛霉产中性蛋白酶的影响趋势为B＞C＞D＞A，即黄豆粉添加量对雅致放射毛霉产中性蛋白酶的影响最显著，其次为KH2PO4、CaCl2、蔗糖添加量。最佳参数组合为A2B1C2D3，即当蔗糖添加量为10%，黄豆粉添加量为2.5%，KH2PO4添加量为0.4%，CaCl2添加量为0.11%时，雅致放射毛霉产蛋白酶酶活最高达1310.56U/mL。

表3 雅致放射毛霉发酵培养基优化正交实验结果Table.3 Orthogonal experiment results for optimization offermentation medium of Actinomucor elegans

2.4.2 五通桥毛霉发酵培养基正交优化结果 在单因素实验的基础上，以A：蔗糖、B：黄豆粉、C：KH2PO4、D：CaCl2的用量为三个因素进行正交实验设计，以蛋白酶酶活作为评价指标。选用L9（34）正交表对五通桥毛霉发酵培养基的最佳参数进行优选，采用SPSS17.0进行分析，结果见表4。

表4 五通桥毛霉发酵培养基优化正交实验结果Table.4 Orthogonal experiment results for optimization offermentation medium of Wutungkiao Mucor

由表4中实验结果及极差RB＞RD＞RC＞RA可知，四个因素对五通桥毛霉产中性蛋白酶的影响趋势为B＞D＞C＞A，即黄豆粉添加量对五通桥毛霉产蛋白酶的影响最显著，其次为CaCl2、KH2PO4、蔗糖添加量。最佳参数组合为A2B2C3D1，即当蔗糖添加量为10%，黄豆粉添加量为3.0%，KH2PO4添加量为0.37%，CaCl2添加量为0.07%时，五通桥毛霉产中性蛋白酶酶活力达1306.38U/mL。

3 结论

本研究以雅致放射毛霉和五通桥毛霉为实验对象，研究了不同发酵培养基成分及添加量对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响，得出雅致放射毛霉产中性蛋白酶的最佳发酵培养基为：蔗糖添加量为10%、黄豆粉添加量为2.5%、KH2PO4添加量为0.4%、CaCl2添加量为0.11%，在此条件下，中性蛋白酶酶活力达1310.56U/mL；五通桥毛霉产中性蛋白酶的最佳发酵培养基为：蔗糖添加量为10%、黄豆粉添加量为3.0%、KH2PO4添加量为0.37%、CaCl2添加量为0.07%，在此条件下，中性蛋白酶酶活力达1306.38U/mL。

研究结果表明，利用优化的培养基进行毛霉发酵产中性蛋白酶，雅致放射毛霉和五通桥毛霉酶活力提高的百分比分别为60.1%和46.7%，此研究成果为缩短腐乳后酵周期及直装腐乳发酵工艺的后续研究奠定了基础。

[1]王家槐.腐乳的营养与保健功能[J].中国酿造，2002，120（4）：82-85.

[2]李金红.腐乳的生产工艺[J].江苏调味副食品，2006，23（1）：39-41.

[3]梁恒宇，程建军，马莺.中国传统大豆发酵食品中微生物的分布[J].食品科学，2004，25（4）：401-404.

[4]王瑞芝.中国腐乳酿造[M].北京：中国轻工业出版社，2008：299-306.

[5]Han B-Z，F M Rombouts，M J R Nout.A Chinese fermented soybean food[J].International Journal of Food Microbiology，2001，65（1-2）：1-9.

[6]Prajapati J B，Nair B M.The histo of fermented foods[J]. Handbook of Fermented Functional Foods，2003：l-25.

[7]Steinkraus K H.Classification of fermented foods：Worldwide review of household fermentation techniques[J].Food Control，1997（8）：311-317.

[8]Prescot M L，Harley P J，Klein A D.Micro-biology[M].New York：McGraw-Hill Companies，Inc，2002：96-121.

[9]李理，罗泽民，卢向阳.毛霉产蛋白酶的特性及其应用研究[J].湖南农业大学学报，1999，25（3）：216-219.

[10]中华人民共和国国家技术监管局.GB/T23527-2009ICS67.22022X69-2009，蛋白酶制剂[S].北京：标准出版社，2009.

[11]鲁绯，孙君社，王丽英.雅致放射毛霉胞外蛋白酶特性的研究[J].中国酿造，2004（12）：8-10.

[12]王丽英，王谦，王家槐.雅致放射毛霉深层培养条件及发酵培养基的优化研究[J].中国酿造，2001，116（6）：17-22.

[13]龙菊，吴拥军，程昌泽.高大毛霉液体发酵培养的优化及产酶特性研究[J].食品工业科技，2008（4）：88.

[14]黄海东.中性蛋白酶高产菌株的选育和发酵条件优化的研究[D].西安：西北大学，1999.

[15]潘进权，罗晓春，王菊芳，等.基于序贯设计的毛霉AS3.2778发酵产蛋白酶工艺优化[J].食品科学，2008，29（12）：481-485.

Optimum fermentation medium of high-yielding neutral protease of mucor

LIU Ying-ying，LIU Ying，ZHANG Guang，SUN Bing-yu，WANG Jin-feng，SHI Yan-guo*
（College of Food Engineering，Key Laboratory of Food Science and Engineering of Common Colleges and Universities in Heilongjiang Province，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Actinomucor elegans and Wutungkiao Mucor were used as experimental materials，through single factor and orthogonal experiments，the optimization of fermentation medium composition for high-yielding protease of two kinds of hair mould was researched.The results showed that the optimal fermentation medium composition for neutral protease of Actinomucor elegans was：sucrose content 10%，soybean flour 2.5%，KH2PO40.4%，CaCl20.11%，the neutral protease activity was 1310.56U/mL.The optimal fermentation medium composition for neutral protease of Wutungkiao Mucor was：sucrose content 10%，soybean flour 3.0%，KH2PO40.37%，CaCl20.07%，the last neutral protease activity was 1306.38U/mL.The improve percentage of neutral protease activities were 60.1%and 46.7%respectively.This research laid the foundation for follow-up study of shortenning the fermentation cycle of fermented bean curd and production process of direct-loading fermented bean curd.

fermentation medium；mucor；neutral protease activity

TS214.2

A

1002-0306（2014）06-0166-05

2013－08－05 *通讯联系人

刘莹莹（1988-），女，硕士研究生，研究方向：大豆化学与深加工技术。

十二五国家科技支撑计划项目（2012BAD34B03-4）。