产凝乳酶微生物的研究概况

李学朋，梁琪，师希雄，冯瑞章，张炎，文鹏程，张卫兵*

产凝乳酶微生物的研究概况

李学朋1，梁琪1，师希雄1，冯瑞章2，张炎1，文鹏程1，张卫兵1*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾644000）

凝乳酶用途广泛，其来源主要有动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶，微生物凝乳酶一直是凝乳酶研究的热点。对近年来国内外产凝乳酶真菌、细菌和放线菌种类以及产凝乳酶微生物的选育的研究情况进行了综述，以期为微生物凝乳酶的研究和开发提供参考。

凝乳酶；微生物；选育

凝乳酶是一种从未断奶的小牛胃中发现的酸性蛋白酶，在食品、医药和饲料等方面都有应用[1]。凝乳酶的主要来源有动物源凝乳酶、植物源凝乳酶和微生物源凝乳酶。动物凝乳酶在干酪的生产中使用最早，应用最为广泛，其中使用最广泛的是小牛皱胃酶，用其生产干酪时凝乳效果好、出品率高，所产干酪硬度和弹性好、苦味少[2]。但由于原料缺乏，凝乳酶价格昂贵。植物凝乳酶凝乳作用强，脂肪损失少，收率较高，但制成的干酪带有一定的苦味。微生物由于生长周期短，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶成本较低、提取方便、经济效益高，可以节约动、植物资源，所以产凝乳酶微生物及其所产凝乳酶一直是人们研究的热点，已经报道的产凝乳微生物包括真菌、细菌、放线菌等[3]。

1 产凝乳酶微生物种类

1.1 产凝乳酶真菌

20世纪60年代初人们开始研究微生物凝乳酶，已经发现产凝乳酶真菌有多种，其中主要包括米黑毛霉（Mucor miehei）、微小毛霉（Mucor pusillus）、栗疫菌（Endothia parasitica）、白腐菌（Trametes versicolor）、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、米根霉（Rhizopus oryzae）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等[4]。

1.1.1 米黑毛霉

米黑毛霉凝乳酶由于凝乳活力与蛋白水力的比值较高，广泛应用于乳品工业[4]。已报道的产凝乳酶米黑毛霉有多种，包括米黑毛霉CBS 37065、米黑毛霉NRRL 3420、米黑毛霉NRRL 3169[5-8]等。STERNBERG M Z等[5]研究了产凝乳酶米黑毛霉NRRL 3420，结果表明，其分子质量为34～39ku，该酶为酸性蛋白酶，在酸性条件下稳定，不是金属蛋白酶，硫酸铝对酶有强烈抑制作用。LAGRANGE A等[6]纯化并比较了米黑毛霉CBS 37065和米黑毛霉NRRL 3169凝乳酶的性质，两者分子质量相同，但氨基酸序列不一致。SEKER S等[7]对米黑毛霉NRRL 3420连续发酵条件进行了研究，结果表明，连续发酵时需要每天补给D-葡萄糖0.625g、pH值不需要控制，转速为400r/min，发酵液酶活可以达到1.24IU/mL。金娟男等[8]将经乙醇分步沉淀所制得的微小毛霉和米黑毛霉凝乳酶进行了比较，米黑毛霉凝乳酶的凝乳效果要好于微小毛霉凝乳酶，在高温和酸性环境要比微小毛霉凝乳酶稳定。

1.1.2 微小毛霉

国内外对产凝乳酶微小毛霉的研究也较多。1968年，ARIMAK等[9]发现了产凝乳酶的微小毛霉（Mucorpusillus），并对微小毛霉凝乳酶的特性研究，发现其具有高活力，酶活可达到4650个酶活力单位。NOUANI A等[10]研究了温度、pH值、CaCl2等因素对一株微小毛霉所产凝乳酶的影响，并与传统动物源凝乳酶进行比较，结果表明，微小毛霉凝乳酶的分子质量为49ku，在65℃加热30min后酶完全失活。最适作用温度为50℃，高于传统凝乳酶的42℃，其他特性与传统动物源凝乳酶极为相似[11]。

矫庆华等[12]从19株真菌中筛出一株微小毛霉602，在含有50%～60%麸皮的半固体培养基中，起始pH 5.0～6.7，28℃培养96h，凝乳酶最高活力为17 000U/g麸皮。补加葡萄糖、蔗糖、硫酸铵、乳清粉均对酶的产生无显著影响。酶的凝乳活力与蛋白水解活力作用的最适温度均为65℃，此酶具有较高的凝乳活力对蛋白水解活力的比值，凝乳酶的pH值稳定范围为4.0～8.0，凝乳酶在60℃保温5min，活力完全丧失。微小毛霉凝乳酶经乙醇沉淀、CM-纤维素、DEAESephadex A25和Sepharose 2B柱层析纯化后，酶的比活提高，蛋白质收率为17.9%。酶的分子质量为41.8ku，酶对血红蛋白的米氏常数Km值为0.019mmol/L，酶的等电点为pH4.3。酶的化学修饰表明，酪氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸以及巯基与酶的活性无关，天冬氨酸的羧基是酶的必需基团，故此酶是一种典型的天冬氨酸蛋白酶[12]。

1.1.3 栗疫菌

栗疫菌（Endothia parasitica）产凝乳酶研究相对较少。SARDINAS J L等[13]从381株细菌和540株真菌中筛选出了一株产凝乳酶的栗疫菌。栗疫菌凝乳酶分子质量为34～39ku；等电点为pH4.5；在60℃加热5min后完全失活；在pH 5.0时最为稳定。在凝乳酶的蛋白水解作用中，栗疫菌凝乳酶能够产生丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸等多种氨基酸，但不能产生色氨酸。HAGEMEYER K等[14]用2种方法对栗疫菌凝乳酶进行了纯化，该酶在pH 4.0～5.0时很稳定，pH 7.0时不稳定，分子质量37.5ku，等电点为pH 4.6。LARSON M K等[15-16]研究了影响栗疫菌凝乳酶活力与稳定性的因素，包括pH值、温度和底物浓度等。

1.1.4 根霉

产凝乳酶的根霉也是一个研究热点。KUMAR S等[17]对一株米根霉的胞外凝乳酶进行了分离纯化，并研究了其酶学特性。该酶经过硫酸铵盐析、离子交换层析和凝胶层析之后，纯化91倍，回收率为26%。酶的最适作用温度为60℃，活化能为63.37J/mol，在30～45℃范围内酶保持稳定；酶的最适作用pH为5.5，在pH 5.5～7.5范围内凝乳酶保持了96%的活力。Ca2+的浓度和酶作用底物浓度与凝乳酶活力之间为双曲线效应。以脱脂乳为反应底物时，酶的米氏常数Km为5mg/mL。该凝乳酶能够被胃蛋白酶抑制剂抑制其凝乳酶活力，证明其为天门冬氨酸蛋白酶。吴进菊等[18]从中国曲中分离出产凝乳酶的根霉F34，进一步研究表明，根霉F34菌株凝乳酶最适作用温度为50℃，最适作用pH值为5.5，Ca2+、Zn2+、Fe2+和Fe3+对凝乳活力有明显促进作用，K+和Mg2+对凝乳活力促进作用不明显，而Na+、Cu2+、Co2+和Li2+对凝乳活力有明显抑制作用。经培养基和培养条件优化，确定了根霉F34产凝乳酶的最佳发酵培养基为米粉麸皮水解液4.5%，豆粉水解液4.0%，CaCl20.3%，KCl 0.5%；最适发酵条件：初始pH值为4.5，发酵温度为34℃，培养时间为60h。滕国新等[19]采用体积分数60%和71%乙醇分级沉淀方法分离酒曲根霉（Rhizopussp.）052凝乳酶，酶蛋白总回收率可以达到51.9%。分别得到凝乳酶活力为14.55U/mg和18.44U/mg的两种组分。进一步使用葡萄糖凝胶（Sephadex）G-100和DE-52提纯凝乳酶，得到纯酶蛋白根霉B4M2凝乳酶，分子质量为36.6ku。Edman降解法测定酶蛋白分子N-末端15个氨基酸为GTGSVPVTDYQNDVE。根霉B4M2凝乳酶在pH1～7范围内、4℃条件下凝乳酶活力保持稳定。酶作用的最适温度为40℃，55℃保持20min完全失去活性。根霉B4M2凝乳酶凝乳能力与小牛凝乳酶相近，蛋白水解能力介于小牛凝乳酶与蛋白酶之间。

1.1.5 其他

除了以上几种研究较多的产凝乳酶真菌外，另外有报道某些米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）、白腐真菌（Trametes versicolor）、亚粘团串珠镰刀（Fusarium subglutinans）、担子菌（Basidiomycetes）、乳白耙菌（Irpex lacteus）、鲁氏淀粉霉（Amylomyces rouxii）等也能产生凝乳酶[20-27]。

表1 不同真菌凝乳酶的特性Table 1 Characteristics of different fungi rennet

1.2 产凝乳酶细菌

国内外对产凝乳酶细菌的研究也比较早，主要集中在产凝乳酶细菌的分离、凝乳酶的酶学性质、分离纯化和培养条件优化等。已报道的产凝乳细菌主要是芽孢杆菌属的细菌。

1.2.1 多粘芽孢杆菌

最早报道的产凝乳酶细菌是多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa），与小牛凝乳酶相比，多粘芽孢杆菌凝乳酶蛋白质水解程度大，乳清发生浑浊，干酪产生苦味。MATTA H等[28]报道了多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）B-17能够产生胞外凝乳酶，且所产凝乳酶具有很好的耐热性，最适作用温度为50℃，最适pH为7.5，分子质量为30ku。

1.2.2 枯草芽孢杆菌

国内外报道较多的产凝乳酶细菌是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。LAVU K R[29]通过凝胶过滤和离子交换层析将Bacillus subtilisK-26凝乳酶纯化了24倍，经十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝胶电泳测定酶分子质量为27 000ku对κ-酪蛋白的Km为2.77mg/mL，酶最适作用pH 7.5，最适作用温度60℃，60℃处理30min酶失活，乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）可使酶不可逆失活，二异丙基氟磷酸（diisopropylfluorophosphate，DFP）对酶没有影响，重金属离子Hg2+和Pb2+可使酶失活。DUTT K等[30]从土壤中分离得到一株产凝乳酶枯草芽孢杆菌，具有较高的凝乳酶活力（milk-clotting activity，MCA）/蛋白水解酶活力（protease activity，PA）（MCA/PA）值。研究结果表明，酪蛋白对凝乳酶的产生具有诱导作用，果糖和硝酸铵能够促进产酶。在培养基（4%果糖、0.75%酪蛋白、0.3%NH4NO3、10mmol CaCl2，pH 6.0）中接种4%（v/v）的种子液，37℃、200r/min培养72h时酶活达到最高，为571.43U/mL。对其发酵培养基进行优化后凝乳活力提高了6.67倍。

胡永金等[31]从采集自云南省的几个奶牛场的土壤样品筛选得到112株产凝乳酶微生物，其中细菌22株，一株枯草芽孢杆菌BB-23产凝乳酶活力高而蛋白水解活力低，该菌在麸皮培养基发酵72h后凝乳酶活力达73.80SU。刘河涛[32]从所采集的10种土壤和干酪样品中分离纯化出的34株微生物中，筛选出能产凝乳酶的枯草芽孢杆菌QL-2，其凝乳活力能达到62.83SU。

1.2.3 地衣芽孢杆菌

TREVOR M等[33]从生乳中分离得到一株产胞外凝乳酶的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。采用70%硫酸铵对该菌株所产凝乳酶进行了初步纯化，进一步研究表明，最适作用温度为65℃，最适pH为5.0～5.5，65℃作用3min后酶失活。AGEITOS J M等[34]纯化并研究了地衣芽孢杆菌USC13凝乳酶的酶学性质。在LB培养基中培养地衣芽孢杆菌USC1能产生62ku的凝乳蛋白酶源，成熟后分子质量变为34ku。

宋曦等[35]利用改进的酪蛋白培养基分离得到的地衣芽孢杆菌D3.11在发酵72h时凝乳酶活力达89.56SU/mL，经优化后凝乳活力提高到134.72SU/mL[36]。

1.2.4 球形芽孢杆菌

EL-BENDARY MA等[37-38]采用丙酮分级沉淀、DEAESephadex A-25和Sephadex G-100将球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）NRC24凝乳酶纯化了48倍，活力达到648 148U/mg。该酶在pH5.7～7.5、温度为55℃时达到最高。Zi2+对酶有激活作用，Ni2+和Hg2+对酶有抑制作用。CaCl2在一定浓度范围内可以使酶激活，NaCl在5%～20%范围内使酶抑制。

1.2.5 黄色粘球菌

CARIAS J R等[39]报道了一株黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）DK101，该菌能产生内切蛋白酶，与凝乳酶一样能特异性地水解Phe-Met之间的肽键，分子质量为45ku。PETIT F等[40]研究了黄色粘球菌DK1622产胞外凝乳酶的条件，结果表明，该菌在pH 6.0时酶活最高。在发酵时间接近9h时酶活达到最高，酶活与菌体量不呈正相关。POZA M等[41-42]从4株黄色粘球菌中筛选得到一株黄色粘球菌422，该菌产生的凝乳酶分子质量为40ku，等电点为5.0，最适pH为6.0，最适温度为37℃，65℃处理12min后酶可完全失活。

1.2.6 粪肠球菌

SATO S等[43]从157株乳酸菌中筛选得到一株产凝乳酶的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）TUA2495L，具有较高的MCA/PA值。所产凝乳酶分子质量为34～36ku，等电点为5.4，Km值为0.61%。最适作用温度为70℃，在pH5.5～10.0的范围内酶比较稳定，Fe2+、Cd2+、Ni2+、Cu2+、Al3+、SDS和EDTA对酶有抑制作用，Co2+、Mn2+和Zn2+对酶有激活作用。

1.2.7 蜡状芽孢杆菌

周俊清[44]从采集自湖南农业大学奶牛场的牛棚中、养牛场院内、排水沟的土壤样品中分离得到一株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）BZ-17，对其进行了诱变选育、培养基和培养条件优化和酶学性质研究。

表2 不同细菌凝乳酶的特性Table 2 Characteristics of different bacteria rennet

1.3 产凝乳酶放线菌

产凝乳酶放线菌主要有嗜热放线菌（Thermoactinomyces）、小单孢菌属（Micromonospora）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsissp.）等。

郭光远等[45]在对云南不同地区放线菌区系及资源的考察过程中，对所分离到的2 127株放线菌中凝乳酶产生菌进行了筛选，产酶菌株有356株，占其中49株产酶活力较高。62%的高温链霉菌菌株产生凝乳酶，产酶活力大于100U/mL的菌株占5.2%；中温链霉菌有11.3%的菌株产生凝乳酶，活性较高的占2.2%。小单胞菌、诺卡氏菌、马杜拉放线菌和高温放线菌等也有产生凝乳酶活性较高的菌株。尽管水生放线菌产酶菌株的比例较高，但高活力的菌株多数来自土壤。

CAVALCANTI M T H等[46-47]研究了诺卡氏菌属所产凝乳酶的部分纯化和酶学特性。经过硫酸铵盐析后，酶的纯化倍数为7.2，产率为55.3%；经过DEAE-cellulose纯化后得到4个活性部分（F4、F5、F6、F7），其中F5部分表现了最好的凝乳酶活性。酶的最适凝乳pH分别为11.0和7.5，最适凝乳温度为55℃，在pH 4.5～11.0范围内都比较稳定，在65℃和75℃加热30min后失活。诺卡氏菌（Nocardiopsissp.）在含豆饼粉1%、不含葡萄糖的培养基中，培养40h时凝乳酶活力达到最高，为24.49 U/mg。

2 产凝乳酶微生物的诱变选育

目前关于高产凝乳酶微生物的诱变育种的研究大多集中在真菌如微小毛霉、黑曲霉、米黑毛霉等。诱变育种的所采用的方法主要有60Co-γ射线诱变、紫外线照射诱变、脱氧胆酸钠诱变、常压低温等离子体诱变、微波辐照诱变和NTG诱变等。郭光远等[45]以毛霉Y85-8512作为出发菌，经诱变选育得到酶活比值高且凝乳活力可达到5 000U/g的菌株。孙建等[48]从17株产凝乳酶的霉菌中通过放射诱变选出1株高产菌株，再进行60Co-γ射线诱变，得到的变异株R132的凝乳活力提高了80%，酶活比值提高了65%。廖亮等[49]以米黑毛霉和黑曲霉为出发菌株，分别进行紫外线照射诱变、脱氧胆酸钠诱变和常压低温等离子体诱变，选育一株凝乳酶产量高，蛋白质水解活力小的黑曲霉L-2-12。邵淑娟等[50]采用微波辐照方法对产凝乳酶的黑曲霉JG进行诱变处理，选育出的突变株WB6-3、WB2-5，凝乳活力分别比出发菌株提高了35%和14%。

3 微生物凝乳酶的底物专一性和结构

不同来源的凝乳酶由于其对作用底物的专一性不同，在凝乳时对κ-酪蛋白的水解位点不同，其在酶解阶段的凝乳机理也不相同。猪胃蛋白酶A和C凝乳酶与小牛皱胃酶相同，水解κ-酪蛋白的目标肽键均为Phe105～Met106[51]。莴苣凝乳酶水解κ-酪蛋白的靶位点为Arg97～His98、Lys111～Lys112或Lys112～Asn113的肽键[52]，合欢凝乳酶则偏好水解Lys116～Thr117[53]。菜蓟凝乳酶对牛和绵羊κ-酪蛋白的主要裂解位点是Phe105～Met106，但对山羊κ-酪蛋白的裂解位点是Lys116～Thr117[54]。在已报道的微生物凝乳酶中，栗疫菌（C.parasitica）蛋白酶水解κ-酪蛋白的目标肽键是Ser104～Phe105[55]；米黑毛霉（R.miehei）凝乳酶水解κ-酪蛋白的目标肽键为Phe105～Met106[51]。

已报道的凝乳酶氨基酸序列和结构均有一定的差异。牛源凝乳酶为单链，有323个氨基酸残基，而雪白毛霉（R.niveus）、高大毛霉（M.mucedo）、佐氏曲霉（A.saitoi）、米黑毛霉（R.miehei）、微小毛霉（R.pusillus）、栗疫菌（C.parasitica）凝乳酶分别含有391、400、394、430、427、419个氨基酸残基。牛源凝乳酶二级结构中主要包含β-折叠和一些小的α-螺旋片，由N端区域和C端区域以双叶折叠的方式形成了带有活性位点Asp32和Asp215的分裂沟。菜蓟凝乳酶的C端区域中含有“Asp-Thr-Ser”模体，酵母菌凝乳酶的C端区域中也含有“Asp-Thr-Ser”模体，这与其他真菌源凝乳酶中含有的“Asp-Thr-Gly”模体不同[56-57]。

4 结论与展望

凝乳酶用途广泛，目前对凝乳酶的需求越来越大，对凝乳酶的研究及开发刻不容缓。微生物源凝乳酶研究，受到了广泛的重视。微生物凝乳酶的研究基础是获得大量高产优良凝乳酶的微生物菌株，虽然关于产凝乳酶微生物资源的研究已取得了一定的成果，但这方面的研究仍需进一步加强和深化。将来产凝乳酶微生物的研究应从以下几方面进一步深化。

（1）筛选更多优良菌种，优良菌株所产的凝乳酶应凝乳活力高而水解活力低，易于生产，成本低，用其生产的干酪质地和风味易被消费者接受。

（2）应用诱变选育技术对产酶菌种进行改良，提高单位产量，降低单位成本，使之更适于工业化生产。

（3）以现有的微生物凝乳酶基因资源为基础，应用基因工程技术提高其表达率，获得更高的产量。

（4）以现有的微生物凝乳酶为基础，应用蛋白质工程技术提高活性。

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Summary on rennet producing microorganisms

LI Xuepeng1,LIANG Qi1,SHI Xixiong1,FENG Ruizhang2,ZHANG Yan1,WEN Pengcheng1,ZHANG Weibing1*
(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province,Yibin University,Yibin 644000,China)

Rennet is widely used in many aspects,it occurs in animal,plants and microorganisms.The variety of rennet-producing fungi,bacteria,actinomycetes,and the breeding situation of rennet producing microorganism were summarized,in order to provide reference for research and development of microbial rennet.

rennet;microorganisms;breeding

Q556

A

0254-5071（2014）04-0013-06

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.004

2014-03-14

发酵资源与应用四川省高校重点实验室开放基金项目（2011KFJ005）；甘肃省自然科学基金项目（1308RJZA260）；十二五"农村领域国家科技计划项目（2011AA100903）

李学朋（1988-），女，硕士研究生，研究方向为乳品微生物。

*通讯作者：张卫兵（1974-），男，副教授，博士，研究方向为应用微生物。