胃癌前病变组织中人端粒酶逆转录酶、p53蛋白的表达与幽门螺杆菌的关系

刘 芳 ，房 青 ，关 劼 ★，李红艳 ，徐 波

（1.中日友好医院 消化内科；2.中日友好临床医学研究所 病理生理室，北京 100029）

胃癌的发生发展是多阶段、多步骤的过程，有多种因素参与。大多数学者认为胃癌可能是幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp） 长期感染与其它因素共同作用的结果。端粒酶和p53的表达被认为和大多数恶性肿瘤的发生密切相关，端粒酶已被认为是胃癌临床诊断的良好指标。有关p53表达和Hp感染关系的研究不少，但研究结论不一致。本课题通过检测胃癌前病变患者的胃粘膜组织中人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA、p53 蛋 白 的 表 达 和Hp感染状况，分析它们的相关性，旨在探讨Hp感染对胃粘膜病变的作用机制。

1 材料和方法

1.1 样品收集

对2004年～2006年间在我院就诊的患者于2007年～2010年再次进行胃镜追踪随访，均于胃窦处提取组织2块，共随访60例，平均随访时间为2年。其中Hp根除者26例 （肠上皮化生16例，慢性浅表性胃炎10例），未根除者10例（肠上皮化生6例，慢性浅表性胃炎4例）；对照组为持续阴性者24例（肠上皮化生11例，慢性浅表性胃炎13例）。治疗方案：①Hp根除方案：奥美拉唑（20mg，2 次 ／d）、阿莫西林克拉维酸钾片（1.125g，2 次／d）、 克拉霉素 （0.5g，2 次 ／d）、 胶体果胶铋（200mg，3/d），疗程 10d，对青霉素过敏者将阿莫西林克拉维酸钾替换为利复星 （0.2g，2次／d）；②对照组用胃粘膜保护剂治疗。所有患者在首次胃镜检查前1个月内均未接受抑酸或抗生素治疗，在治疗结束停药1个月后复查胃镜。

1.2 试剂

采用Warthin-Starry改良银染法检测胃粘膜组织中Hp感染，采用实时定量RT-PCR分析胃粘膜组织中端粒酶表达水平，所需Trizol试剂、SYBR Green ER试剂盒购自美国Invitrogen公司 。 靶 序 列 ：hTERTF：5'-Cgg，AAg，AgT，gTC，Tgg， AgC，AA-3'，hTERTR；5'-ggA，TgA，AgC，ggA， gTC，Tgg，A-3'。 内对照物：β-actinF （5'－TCT ACG AGG GCT ATG CTC TCC-3'）；β-actinR（5'－GGA TGC CAC AGG ATT CCA TAC-3'）。

1.3 方法

1.3.1 Hp感染检测

采用Warthin-Starry改良银染法检测胃粘膜组织中Hp感染情况，显微镜下见到典型的短棒状或螺旋状棕黑色颗粒判为Hp阳性。根据银染的数量，＜10%为阴性 （-），10%～50%为弱阳性（+），50%～75%为中等阳性（++），≥75% 为强阳性（+++）。

1.3.2 端粒酶hTERT表达水平的检测

采用实时荧光定量RT-PCR方法检测胃粘膜组织中hTERT mRNA表达水平，用Trizol试剂按标准程序提取组织总RNA，将组织块在研钵中加入液氮研磨成粉末，按50～100mg组织加入1ml Trizol试剂，转移到2ml离心管中，加入 200μl氯仿，离心后吸取上层水相，异丙醇沉淀后，75%乙醇洗2次，用DEPC水溶解RNA沉淀。

用SYBR Green ER试剂盒中的逆转录酶将1μg RNA逆转录成cDNA，取50ng cDNA加入PCR扩增预混液中，在ABI 7700实时定量PCR仪上进行hTERT定量分析，条件为95℃融解15s，60℃退火/延伸 45s，共 40 个循环。 以 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）为内参照。

将hTERT与GAPDH拷贝数之比的100倍作 为 标 准 化 hTERT （normalizedhTERT，NhTERT），即：NhTERT=（hTERT/GAPDH）×100。

1.3.3 p53蛋白的检测

免疫组化检测p53蛋白的表达采用链霉素亲生物素——过氧化酶联接法（SP法），常规固定、切片，染色，设立阳性和阴性对照。选取具有适当形态学特征的细胞用于评估。高倍镜下选择5个代表性视野计数，胞核呈棕黄色的平均阳性细胞数＞5%判断为阳性，＜5%为阴性。

1.4 统计学分析

采用SPSS16.0统计分析软件处理数据，多组计量资料的比较采用t检验。计算Pearson相关系数和检验，用SPSS 11.5统计软件包进行处理。

2 结果

Hp阳性患者共36例，Hp阴性患者共24例。表1示，hTERT及p53蛋白的表达水平在Hp阳性患者中显著高于Hp阴性患者。

表2示，Hp根除者治疗后hTERT与治疗前相比显著下降 （P＜0.05），Hp根除组 hTERT与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）；未根除者与对照组上述指标均无显著性差异（均P＞0.05）。

表1 治疗后Hp阳性和阴性组的hTERT mRNA表达水平

表2 Hp根除前后hTERT mRNA表达的变化

3 讨论

端粒酶活性与恶性肿瘤的发展有密切关系，人端粒酶逆转录酶（hTERT）的活性，使细胞不能灭亡，从而导致肿瘤的发生[1]。

p53基因的变异和hTERT基因的激活在胃癌的增殖和恶化中起到关键的作用[2]。王国安等[3]研究显示hTERT表达率在萎缩性胃炎、肠化生、异型增生和胃癌等不同粘膜癌变过程中呈递增趋势。Hp感染为胃癌的发病因素之一已得到共识，Hp具体的致癌机制目前仍不清楚。Hp感染与端粒酶活性之间的关系是目前的研究热点，Kashima等[4]在Hp感染与端粒酶活性关系的研究中发现，正常胃粘膜中无端粒酶活性表达，胃癌组织端粒酶活性明显升高为83.3%；Hp阳性组胃粘膜端粒酶活性为50.7%，明显高于Hp阴性组17.2%（P＜0.01），根除 Hp 后端粒酶活性（40.0%，4/10）明显低于根除治疗前（90.0%，9/10）（P＜0.05），认为Hp阳性胃疾病端粒酶活性增强，根除Hp后端粒酶活性明显低于根除治疗前。本研究表明，Hp阳性组hTERT表达明显增高于Hp阴性组，提示端粒酶活性在胃癌前病变阶段已经发挥作用。朱亚杰等[5]研究发现，p53蛋白转录调控活性的变化在胃癌的发生发展中起着重要的作用，p53突变可以影响其转录调控活。本研究表明，Hp阳性组p53蛋白表达明显增高于Hp阴性组，随着Hp的根除治疗表达有明显降低，提示p53蛋白与Hp感染有关系。国外已有研究对癌症患者手术、化疗或放疗前后组织中和血浆中的hTERT mRNA进行实时定量检测，可指导诊治及评估预后。利用hTERT基因进行靶向性基因治疗也是目前国内外研究的热点[6]。

Hu等[7]将胃粘膜肠上皮化生伴 Hp感染和肠上皮化生不伴Hp感染分2组，用Trap法测定其端粒酶活性，结果显示肠上皮化生伴 Hp感染端粒酶活性高于不伴Hp感染的肠上皮化生，且有显著性差异。本研究表明Hp阳性组患者的端粒酶活性定量高于Hp阴性组，根除后明显降低。提示Hp感染是胃粘膜上皮端粒酶激活的主要机制之一。Hp诱导的粘膜增殖可能涉及多个不同水平的调控环节。研究表明在胃癌演变的初始阶段，Hp 可能导致 TNF、iNOS、CD95、Fas受体表达和capase活化，进而增强P27蛋白表达，使Rb蛋白丝氨酸残基磷酸化减少，细胞周期蛋白E相关CDK2激酶活性显著降低，进而细胞分化G1、S期被抑制，从而诱导细胞凋亡[8]。Yan等[9]研究认为在p53基因发生突变的细胞系MKN28中p53蛋白转录活性最低，进一步提示p53突变可以影响其转录调控。因此，深入探讨Hp与端粒酶及p53蛋白的关系及机制对胃癌的防治具有重要意义。

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