加减尪痹舒安对胶原诱导性关节炎大鼠症状及血清炎症因子的影响

赵 颖 ，王伟钢 ★，肖 诚

（1.中日友好医院 国际医疗部一病区，2.中日友好医院 科研处，北京 100029）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以对称性多关节炎病变为主要临床表现的全身性自身免疫性疾病。其特点是关节滑膜的慢性炎症、软骨吸收、骨质破坏和骨质纤维化。RA这种以关节炎症为主的慢性反复发作的全身性疾病，属中医学“痹证”范畴。本文旨在建立胶原诱导型关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型[1]的基础上观察加减尪痹舒安对CIA大鼠的治疗效果，并检测其对模型鼠血清白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[2，3]、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）[4，5]水平的影响，以探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药品、试剂、仪器

选用160g～180g SPF级雄性Wistar大鼠 32只，由中国药品生物制品检定所提供，动物许可证号：SCXK（京）（2008-0005）。 在中日友好医院 SPF级动物室喂养，实验动物室许可证号：SYXK（京）（2005-0025）。

甲氨喋呤（methotrexate，MTX）：上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产，批号060502，用无菌蒸馏水制成水药液，浓度为0.1mg/ml。

加减尪痹舒安的制备：川断12g、补骨脂9g、炒黄柏 9g、地骨皮 9g、知母 12g、骨碎补 9g、赤白芍各 9g、秦艽20g、威灵仙 12g、制乳香 6g、制没药6g、忍冬藤20g、络石藤20g、桑寄生20g、蚕砂10g、地鳖虫 6g、怀牛膝 9g、青风藤 15g、生熟地各6g，共含生药 234g，水煎过滤，浓缩至 90ml，生药浓度2.6g/ml。4℃储存备用。

实验试剂有牛Ⅱ型胶原（sigma公司产品）；弗氏不完全佐剂 （Freund’s Adjuvant incomplete，sigma公司产品）；醋酸（北京现代东方精细化学品有限公司产品）；10%中性福尔马林 （北京现代东方精细化学品有限公司产品）；EDTA缓冲液 （北京现代东方精细化学品有限公司产品）；IL-1β、TNF-α放免试剂盒（华英生物有限公司产品）。

实验仪器：低温冷冻离心机（北京医用离心机厂）、显微镜 OlympusBX-60（日本）、电子天平（1/1000，A2000S）德国产。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药方法

健康清洁级雄性Wistar大鼠32只，适应性喂养3d后，随机分为4组。正常对照组、CIA模型组、加减尪痹舒安组和MTX组。

实验前1d用牛Ⅱ型胶原溶于0.1mol/L醋酸中，4℃冰箱过夜，按2mg/ml比例与弗氏不完全佐剂1∶1充分混和乳化。取适量牛Ⅱ型胶原溶液（浓度2mg/ml）逐滴加入至等容积的不完全弗氏佐剂中，牛Ⅱ型胶原终浓度为1mg/ml。冰浴中用匀浆器充分乳化，以滴入水中不扩散为度，取乳化后的混合物按0.2ml（即200μg牛Ⅱ型胶原）/只，于尾根部皮下注射。7d后按0.1ml（即100μg牛Ⅱ型胶原）/只，于尾根部皮下加强免疫1次。

正常对照组和CIA模型组均消毒饮用水灌胃，3ml/次，Qd，连续49d。加减尪痹舒安组以加减尪痹舒安煎液灌胃，3ml/次，Qd，连续49d。相当于39g/kg/d。MTX组：MTX药液以1.6mg/kg/d灌胃，3ml/次，1次/周，其余每天给予饮用水，连续49d。

1.2.2 观察指标

（1）一般行为表现：动物神态、毛色、活动情况、饮食量、大小便。（2）体重：每3d用电子天平称量各组动物体重。（3）全身关节病变程度。按5级评分法评价，根据肿胀肢体的病变程度累及积分，计算出关节炎指数（arthritis index，AI）。 0 分：无红肿；1分：小趾关节红肿；2分：趾关节及足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的部分足爪肿胀。四肢关节的积分累计即为每只大鼠的 AI。 （4）IL-1β、TNF-α：末次用药24h以后，采用质量分数为10%的水合氯醛溶液按大鼠体重以0.3ml/100g予腹腔内注射麻醉，腹主动脉抽血4～6ml，室温静置30min后2500r/min离心15min，用吸液管取血清，置于冻存管-20℃冰箱待测。放射酶联免疫学方法测定血清IL-1β、TNF-α水平。

1.3 统计学方法

采用SAS10.0软件进行数据分析，各样本均数间比较进行方差分析。

2 结果

2.1 一般状态及体重变化

对照组大鼠随着饲养时间的延长，体重不断增加、活动自如、皮毛有光泽、精神状态好，无异常状态出现。模型组大鼠出现毛发干枯、饮食减少、精神萎靡，后期可见负重困难及关节活动障碍等。加减尪痹舒安组及MTX组大鼠的饮食情况较模型组好。

表1示，造模前4组大鼠体重无显著性差异（均P＞0.05）；给药49d后，CIA模型组及加减尪痹舒安组大鼠体重较正常对照组显著减轻 （P＜0.01），加减尪痹舒安组大鼠体重增加与模型组相比存在显著性差异（P＜0.05）。

2.2 关节炎指数评分变化

造模后正常对照组为0，CIA模型组为9.12±2.73， 加减尪痹舒安组 6.34±3.71，MTX组 6.11±3.69。用药组与模型、对照组相比均无显著性差异（均 P＞0.05），但有改善趋势。

2.3 各组血清IL-1β、TNF-α 水平

表2示，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α值与其余各组相比均显著升高（均P＜0.01）；用药组与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。MTX、加减尪痹舒安有降低CIA大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量的作用，能够减轻大鼠的足爪肿胀。

表2 各组血清IL-1β、TNF-α 水平（n=8）

3 讨论

RA属于中医学“痹症”范畴。中医对其治疗原则包括清热化湿通络活血、补肾强筋。现代药理研究表明此类中药具有抗炎免疫，抗血小板聚集，促进成骨细胞、抑制破骨细胞功能，可提高下丘脑-垂体-性腺轴的功能，调节性激素水平，符合现代医学理论。

尪痹病名是焦树德教授于80年代提出的，逐步得到中医界认可。补肾祛寒治尪汤系列方在临床上取得了良好效果，其尪痹舒安方是以补肾清热治尪汤为主加减，动物实验药效学显示其具有消肿抗炎止痛作用。加减尪痹舒安的组方是根据焦树德教授治疗尪痹（RA）的补肾清热治尪汤化裁而来，是针对肾虚标热重证，临床多见于类风湿关节炎的急性期。其治疗原则是补肾清热、化湿疏风、活血通络。以朱丹溪的潜行散及焦老自拟的清热散痹汤加补肾强骨之品组合而成，临床应用取得了较好的效果。同时符合现代药理研究，川断、补骨脂、炒黄柏、地骨皮、知母、赤白芍、秦艽、青风藤、生熟地具有抗炎免疫作用，补骨脂、杜仲、牛膝、骨碎补具有抑制破骨细胞活性促进成骨细胞增殖作用。

Ⅱ型胶原是目前较为公认的关节软骨特异性抗原。CIA动物模型是Trentham等在1977年首次建立的实验性关节炎动物模型，所用的抗原是将纯化的天然胶原溶于醋酸制成浓度1mg/ml的溶液，与等量的弗氏佐剂或不完全佐剂混合成稳定的乳剂[6，7]。大量研究表明，CIA模型在临床症状病理表现方面都与RA极为相似。CIA模型已成为研究RA常用的实验动物模型[8～10]。

RA滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核/巨噬细胞、淋巴细胞等产生大量的细胞因子，这些细胞因子通过作用于多种细胞并相互调节，形成一个复杂的网络，促进了RA的发生和发展。而其中一些炎性细胞因子如 TNF-α、IL-1、IL-15、IL-18、IL-6、IL-12和IL-17等在RA滑膜病变中起核心作用，所以本实验选取了IL-1β、TNF-α这2个指标。

本实验结果示：加减尪痹舒安能减轻大鼠的足爪肿胀，改善症状和体征，其可能的作用机制为降低大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，具体机理还有待于进一步研究。

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