宫颈癌患者阴道微生物的分布特点

逯彩虹，李保红，李小斌，王海波，刘丽宁，戴卫红，李萍

（1.白求恩军医学院外科教研室，石家庄 050000；2.解放军260医院院办公室，石家庄 050041；3.解放军白求恩国际和平医院药剂科，石家庄 050000）

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择于中国人民解放军260医院、河北医科大学第四医院就诊患者与普查者387例，均为生育期妇女，分为4组：正常宫颈组65例，慢性宫颈炎组70例，宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）组110例，宫颈癌组142例。慢性宫颈炎由宫颈液基脱落细胞学检查确诊为正常或炎性改变；CIN与宫颈癌均由宫颈活检病理确诊。

1.2 研究方法

1.2.1 滴虫与霉菌检测：用悬滴法将阴道分泌物悬浮于生理盐水载玻片上，立即镜检；每张载玻片随机10个高倍视野，看到滴虫或霉菌结果为（+），未看到为（－）。

1.2.2 细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）检测：采用BV快速诊断试剂盒。取宫颈口分泌物，观察反应体颜色的变化，深黄绿色为弱阳性，绿色为阳性，蓝色为强阳性。绿色与蓝色为BV（+），否则视为（－）。

1.2.3 衣原体的检测：取宫颈口分泌物，加反应液，将处理好的样品2~3滴加于检测试剂盒的加样孔中，在C质控区有一条红线、T检测区无红线出现为阴性结果，检测区与质控区均有红线出现则为阳性结果。

1.2.4 支原体的检测：用棉拭子自宫颈口旋转数圈取出宫颈分泌物，立即置于培养瓶中培养24~48 h，培养剂不变色为阴性结果，由原来的黄色变为红色则为阳性结果。

1.2.5 HPV16/18的检测：采用HPV16、18型核酸扩增（PCR）荧光检测法：HPV16反应液检测Ct值＜37为HPV16型DNA阳性；HPV18反应液检测Ct值＜37为HPV18型DNA阳性。

1.2.6 淋菌的检测：采用革兰染色法，镜下看到成对的革兰阴性球菌为阳性结果，否则为阴性结果。

1.2.7 乳酸杆菌的检测与计数：采用蘸有生理盐水的棉拭子在阴道侧穹隆采取阴道分泌物，平行滚动平铺载玻片上，自然干燥，革兰染色后，采用油镜观察乳酸杆菌并计数。

由于建筑市场竞争激烈，承包商在索赔中常常处于被动的地位，要想索赔成功，就要改变这种状况。一是进行相关关系分析。在合同实施过程中，承包商有着多方面的合作关系，如业主、监理单位、设计单位、供货商、其他承包商、业主上级、政府部门等。承包商可以利用这些关系，争取他们的理解、同情、合作和支持，营造有利于承包商的氛围，从各个方面影响业主；二是对方心理的分析。业主的目的是实现标的，尽快投入生产运营，所以工程进度往往成为业主最想控制的目标，索赔时可以适时地利用这一点；三是攻其弱点，创造条件。发现对方弱点之后，就要采取手段进行攻击，以改变索赔条件。

1.3 观察指标

各种病原体感染情况根据检出率，2种及2种以上病原体感染为混合感染，连续计算5个高倍视野乳酸杆菌数量，取平均每个高倍视野乳酸杆菌数量为乳酸杆菌定植密度（个/HP）。

1.4 统计学分析

采用SAS8.0软件，各组乳酸杆菌定植密度比较采用秩和检验与q检验（两两比较），各种病原体检出率比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳酸杆菌在阴道黏膜的分布特点

宫颈癌患者乳酸杆菌定植密度中位数为125（68~198）个/HP，明显低于 CIN 组的 221（119~308）个/HP；CIN患者乳酸杆菌定植密度低于正常宫颈组的294（163~388）个/HP和慢性宫颈炎组的282（212~374）个/HP（P＜ 0.01）。正常宫颈组与慢性宫颈炎组比较，乳酸杆菌定植密度无统计学差异（P＞0.05）。见图 1。

2.2 各种病原体检出率比较

宫颈癌患者阴道黏膜中霉菌、滴虫、支原体、衣原体、BV、HPV的检出率分别高于CIN组、慢性宫颈炎组与正常宫颈组（P＜0.01）。CIN组患者霉菌、滴虫、支原体、衣原体、BV、HPV感染率高于正常宫颈组与慢性宫颈炎组（P＜0.01）；正常宫颈组与慢性宫颈炎组比较各种病原体的检出率无统计学差异（P＞0.05）。淋菌在各组中感染率非常低，各组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

宫颈癌组中，乳酸杆菌阴性患者霉菌、滴虫、支原体、衣原体、BV、HPV的检出率与乳酸杆菌阳性患者比较无统计学差异（P＞0.05）。CIN组、慢性宫颈炎组、正常宫颈组中乳酸杆菌阴性患者霉菌、滴虫、支原体、衣原体、BV、HPV的检出率均明显高于乳酸杆菌阳性患者（P＜0.01）。淋菌感染率低，各组中乳酸杆菌阳性患者与阴性患者比较均无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

图1 宫颈癌组、C I N组、正常宫颈组乳酸杆菌定植密度 ×400Fig.1 Planting density of lactobacillus in cervicalcancer，C I N，and normal cervix groups ×400

表1 各组阴道黏膜常见病原体检出率比较［n（%）］T ab.1 D etection rates of common pathogens in the vaginal mucosa in 4 groups［n（%）］

表2 乳酸杆菌阳性组与阴性组中常见病原体检出率比较［n（%）］T ab.2 D etection rate of common pathogens in subgroups with or without lactobacillus infection［n（%）］

2.3 感染亚组与非感染亚组乳酸杆菌定植密度比较

各组中，几种细菌均无感染的为非感染亚组，有一种或多种细菌感染的为感染亚组。宫颈癌组中感染亚组乳酸杆菌定植密度84个/HP，明显低于CIN组136个/HP、慢性宫颈炎组248个/HP和正常宫颈组259个/HP（P＜0.01）；CIN组感染亚组乳酸杆菌定植密度低于正常宫颈组与慢性宫颈炎组（P＜0.01）。宫颈癌组中感染、非感染亚组阴道黏膜中乳酸杆菌的定植密度分别为84和142个/HP，差异无统计学意义（P＞0.05）。CIN组（感染亚组136个/HP，非感染亚组254个/HP）、慢性宫颈炎组（感染亚组248个/HP，非感染亚组367个/HP）和正常宫颈组（感染亚组259个/HP，非感染亚组356个/HP）中感染亚组乳酸杆菌的定植密度明显低于非感染亚组（P＜0.01）。

2.4 HPV感染者阴道黏膜乳酸杆菌分布特点比较

宫颈癌组HPV感染者中乳酸杆菌阴性率为66.9%，高于CIN组60.4%、慢性宫颈炎组35.7%与正常宫颈组37.5%（P＜0.01）；宫颈癌组与CIN组比较、慢性宫颈炎组与正常宫颈组比较，乳酸杆菌阴性率均无统计学差异（P＞0.05）。比较感染HPV且乳酸杆菌阳性的患者中乳酸杆菌定植密度，宫颈癌组为114个/HP、CIN组129个/HP，低于慢性宫颈炎组251个/HP、正常宫颈组249个/HP（P＜0.01）。见表3。

表3 H PV感染者阴道黏膜乳酸杆菌阴性率以及乳酸杆菌定植密度比较T ab.3 N egative rate and planting density of lactobacillus in patients with H PVinfection in 4 groups

2.5 各组阴道黏膜中病原体分布特点比较

正常宫颈组中霉菌的检出率最高，其次是衣原体、支原体、BV、HPV、滴虫。慢性宫颈炎组中检出率最高的是支原体、HPV，其次是衣原体、霉菌、BV，滴虫检出率不高。CIN组中BV明显增高，与HPV的检出率接近，其次是支原体、衣原体、霉菌、滴虫。宫颈癌组中HPV的检出率明显超过BV，其次是衣原体、支原体、霉菌、滴虫。各组中淋菌检出率很低。见表1。

3 讨论

目前研究证实，乳酸杆菌有很好的抗感染、抗肿瘤作用［4，5］。HPV是女性阴道中较常见的病原体，正常情况下其感染时间短暂、依靠阴道黏膜的自净很快消失。如果HPV在阴道长期持续感染，则会导致宫颈上皮的异常增生与癌变。在理论上考虑以乳酸杆菌为主的阴道黏膜菌群失调可能与宫颈癌发病有关。

本研究发现，在正常宫颈组与慢性宫颈炎组中乳酸杆菌的定植密度较高，各种病原体感染率较低，但在CIN组、宫颈癌组中乳酸杆菌的定植密度逐渐降低，同时各种病原体感染率明显上升。除宫颈癌组外，各组乳酸杆菌阴性患者中各种病原体的检出率明显高于乳酸杆菌阳性患者，可见乳酸杆菌与各种病原体的感染有拮抗作用。但是在宫颈癌组中乳酸杆菌阳性患者与阴性患者比较各种病原体的感染率无统计学差异，我们分析原因可能与在宫颈癌组乳酸杆菌阳性患者中乳酸杆菌的定植密度明显下降有关，即当乳酸杆菌下降到一定程度，则抗病原体的功能明显下降甚至丧失。说明宫颈癌患者阴道黏膜存在菌群失调。

在110例CIN患者中，伴宫颈糜烂者只有59例（53.64%）。一方面说明宫颈糜烂患者阴道中不存在菌群失调，另一方面也说明宫颈糜烂并不一定是宫颈恶性病变的必经病理过程。与正常宫颈组与慢性宫颈炎组比较，CIN组中BV、HPV的发病率明显升高，而乳酸杆菌密度明显下降，说明乳酸杆菌定植密度下降而导致HPV、BV发病率明显增高，同时也说明CIN组已经开始出现阴道菌群失调。

分析比较感染亚组与非感染亚组中乳酸杆菌定植密度结果显示，在正常宫颈组、慢性宫颈炎组、CIN组中感染亚组乳酸杆菌的定植密度均明显小于非感染亚组，但在宫颈癌组中无统计学差异。组间比较，正常宫颈组与慢性宫颈炎组感染者乳酸杆菌定植密度无统计学差异，但随着感染率的增加，CIN组、宫颈癌组中感染者乳酸杆菌的定植密度也在逐渐下降。

分析各组HPV感染者阴道黏膜中乳酸杆菌分布情况，宫颈癌组与CIN组乳酸杆菌阴性率高，明显高于正常宫颈组与慢性宫颈炎组。在HPV感染患者乳酸杆菌阳性者中比较，宫颈癌组、CIN组乳酸杆菌定植密度小于正常宫颈组与慢性宫颈炎组，说明乳酸杆菌减少、缺失与HPV感染、宫颈癌及其癌前病变有关。

在本研究中，发现在各组中感染率高的病原体有霉菌、支原体、衣原体、BV、HPV，滴虫感染率相对少，淋菌很少感染，可见霉菌、支原体、衣原体、BV、HPV是阴道常见的感染病原体。在正常宫颈组中霉菌的感染率最高，有研究认为乳酸杆菌与霉菌有共生作用，因为乳酸杆菌的增加阴道的酸度，而霉菌容易在酸性环境下生长，在正常情况下霉菌繁殖并与乳酸杆菌共存在一定程度上共同维持正常阴道生态环境，但乳酸杆菌在与霉菌共生同时也会很好抑制霉菌过度繁殖，随着乳酸杆菌的减少，霉菌的感染率也会明显增加。McNicol等［6］研究发现阴道中乳酸杆菌存在导致HPV检出率明显降低，本研究发现随着宫颈病变程度加重、乳酸杆菌的减少，HPV增加最为明显。Discacciati［7］研究发现宫颈鳞状上皮内瘤变患者中BV的检出率高达33%，而正常妇女只有12%。本研究发现CIN中BV的检出率高达45.5%、正常宫颈妇女只有18.5%，随着乳酸杆菌减少，除HPV外，BV的感染率明显增加。本研究发现随着乳酸杆菌的减少，支原体、衣原体的感染也逐渐增加，卢芳国等［8］也有类似的观察，发现乳酸杆菌阴性者衣原体检出率（63.41%）明显高于乳酸杆菌阳性者（51.01%）。本研究认为乳酸杆菌减少、HPV和BV感染在宫颈癌形成过程中起很重要的作用，衣原体、支原体的感染也有一定作用。有人研究滴虫的感染与CIN以及宫颈癌有密切的关系，但本研究认为滴虫感染与CIN、宫颈癌发病无关。淋菌在各组的感染率均很低，与阴道微生物环境失调、宫颈癌发病无关。

总之，本研究发现乳酸杆菌在阴道黏膜上定植数量的减少会导致各种病原体感染的增加，阴道微生态环境的严重失调，增加宫颈上皮细胞异常增生与恶变形成CIN以及宫颈癌。维持与保护阴道生态环境、开发乳酸菌食品与药品在预防与治疗宫颈癌中起非常重要的作用。Aires等［9］研究发现乳酸杆菌可以很好地表达HPV-16 VLPs病毒颗粒，用乳酸杆菌携带VLPs病毒颗粒进行黏膜疫苗治疗宫颈癌。开发乳酸杆菌制剂与疫苗基因工程预防与治疗宫颈癌有着很好的、广泛的应用前景。

［1］郑晶晶，宋静慧.阴道乳酸菌的微生态学研究进展［J］.内蒙古医学院学报，2009，31（4）：431－435.

［2］刘畅，郭晓奎.乳酸菌基因组学研究进展［J］.中国微生态学杂志，2006，18（4）：328－330.

［3］Witkin SS，Linhares IM，Giraldo P.Bacteria flora of the female genital tract：function and immune regulation ［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2007，21（3）：347－354.

［4］Femia AP，Luceri C，Dolara P，et al.Antitumorigenic activity of the prebiotic inulin enriched with oligo fructose in combination with the probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis on azoxymethane-induced colon carcinogenesisin rats［J］.Carcinogenesis，2002，（23）11：1953－1960.

［5］Seow SW，Rahmat JN，Mohamed AA，et al.Lactobacillus species is more cytotoxic to human bladder cancer cells than Mycobacterium Bovis（bacillus Calmette-Guerin）［J］.JUrol，2002，168（5）：2236－2239.

［6］McNicol P，Paraskevas M，Guijon F.Variability of polymerase chain reaction-based detection of human papillomavirus DNA is associated with the composition of vaginal microbial flora［J］.Med Virol，1994，43（2）：194－200.

［7］Discacciati MG，Simoes JA，Lopes ES，et al.Is bacterial vaginosis associated with squamous intraepithelial lesion of the uterine cervix?［J］.Diagn Cytopathol，2006，34（5）：323－325.

［8］卢芳国，胡建中，伍参荣，等.阴道乳酸杆菌生物拮抗作用的调查研究［J］.实用预防医学，2001，8（1）：19－20.

［9］Aires KA，Cianciarullo AM，Carneiro SM，et al.Production of human papillomavirustype16 L1 virus-like particles by recombinant Lactobacillus casei cells［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72（1）：745－752.