大熊猫阴道源乳酸杆菌生物学特性研究

2017-08-07马晓平杨天意张志和王承东

浙江农业学报 2017年7期

马晓平，杨天意，俞演，张志和，王承东，古玉

(1.四川农业大学动物医学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川成都611130； 2.成都大熊猫繁育研究基地，四川成都610000； 3.中国保护大熊猫研究中心，四川雅安 625000； 4.四川农业大学生命科学院，四川雅安 625014)

大熊猫阴道源乳酸杆菌生物学特性研究

马晓平1，杨天意1，俞演1，张志和2，*，王承东3，古玉4，*

用大熊猫阴道源的3株乳酸杆菌(LactobacillussalivariusGPV01、LactobacillusplantarumGPV02和LactobacillussaerimneriGPV03)作为试验组，用人阴道源3株乳酸杆菌(LactobacillusacidophilusWAV01、LactobacilluscrispatusWAV02和LactobacillusplantarumWAV03)作为对照组，进行产过氧化氢能力、耐酸性、耐热性、抗菌活性、药物敏感性及黏附性研究。结果表明：在相同的培养条件下，L.salivariusGPV01、L.plantarumGPV02和L.saerimneriGPV03的产H2O2能力和耐热能力不及L.acidophilusWAV01、L.mcrispatusWAV02和L.plantarumWAV03。L.salivariusGPV01、L.plantarumGPV02和L.plantarumWAV03具有很好的酸耐性，在培养基pH为2～3之间时，3株菌的D值在0.2～0.55之间，其中L.plantarumGPV02的D值最高，达到0.55。同时，6株乳酸杆菌的培养上清液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌均有不同程度的抑制作用，6株乳酸杆菌对3种致病菌的抑制作用远弱于pH 3.5的乳酸。6株乳酸杆菌对多西环素、氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、阿莫西林高度敏感，而对四环素和利福平一般敏感。6株乳酸杆菌对链霉素、氧氟沙星、庆大霉素、复方新诺明、环丙沙星、磺胺甲基异恶唑表现出耐药。6株乳酸杆菌均能黏附到Hela细胞上，GPV01、03，WAV01、03对 Hela细胞的平均黏附数为18.8～32.8 ·cell-1。 WAV02黏附能力最强(54.75±2.40)个·cell-1，而GPV02黏附能力最弱(6.83±0.33)·cell-1。

大熊猫；乳酸杆菌；生物学特性

乳酸杆菌是在人及动物的阴道、胃肠道、口腔等湿润黏膜表面生长的厌氧菌，阴道乳酸杆菌是妇女阴道的“健康卫士”，近年已从阴道内分离出的乳酸杆菌有16种[1]。乳酸杆菌是育龄健康妇女阴道内正常菌群的优势菌，对阴道微生态平衡发挥重要的调节作用[2]。国内外均有使用不同乳酸杆菌制剂用于阴道感染治疗[3]。本实验室前期采用454高通量测序研究发现，部分大熊猫阴道内乳酸杆菌属只占0.01%[4]，表明大熊猫阴道内乳酸杆菌不足。这是否与部分成年雌性大熊猫不孕有关，大熊猫阴道中的乳酸杆菌与人阴道中的乳酸杆菌的生物学特性又有何差异。为此，本试验对3株大熊猫阴道源乳酸杆菌和3株人阴道源乳酸杆菌的生长曲线、产H2O2能力、耐酸性、耐热性、抑菌能力、药物敏感性以及对Hela细胞的黏附性进行研究，为进一步研究大熊猫阴道益生菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验乳酸杆菌，细胞和实验动物

大熊猫阴道源乳酸杆菌3株由本实验室分离鉴定并提供，分别是：LactobacillussalivariusGPV01，LactobacillusplantarumGPV02和LactobacillussaerimneriGPV03。从育龄妇女阴道分泌物样本分离鉴定到的3株乳酸杆菌，即LactobacillusacidophilusWAV01，LactobacilluscrispatusWAV02和LactobacillusplantarumWAV03。后文以菌株编号代表相应的菌株。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(SAU)[CMCC(B)26003]购于中国药品生物制品检定所，溶血性链球菌(SS)由本实验室鉴定收藏，Hela细胞株(ATCC)购自上海雷蒂生物科技发展有限公司。35只SPF级小鼠体重18～22 g(3～4周龄)作为试验动物，小鼠以5只为一笼饲养(小鼠购于成都实验动物中心)。

1.2 试验仪器设备和试剂

Thermo二氧化碳培养箱；CKX41奥林巴斯倒置显微镜；UV756CRT紫外分光光度仪(元析科技有限公司，上海)；PE-2400型PCR扩增仪(Perkin Applied Biosystems，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)；GelDocXR凝胶成像系统；DP70数码照相装置(Olympus公司，日本)；JY600C电泳仪(君意东方电泳设备有限公司，北京)，320 pH计(Mettler Toledo Delta)。

DMEM(高糖型，4 500 mg·L-1，默克密理博)、胎牛血清(FBS)(Gibco®)、2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、LAPTg肉汤培养基(Broth)。青霉素和链霉素(哈尔滨制药集团)购自成都康迪生物技术有限公司；抗生素药敏纸片和胰蛋白胨等试剂购自杭州微生物试剂有限公司；过氧化氢测试盒购自南京建成生物有限公司。

1.3 生长曲线及菌液pH曲线的测定

取0.5 mL活化的乳酸杆菌菌液接种于10 mL LAPTg肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养20 h后，置于漩涡混合器上摇匀，然后取0.5 mL接种于装50 mL LAPTg肉汤培养基的培养管中，于37 ℃培养24 h，每l h取出1 mL菌悬液测定其活菌数、D600和pH。活菌数的测定采用常规梯度稀释法，将MRS琼脂培养板分为9格，分别取10-5、10-6、10-7稀释度的菌液10 μL滴到MRS平板培养基的格上，吹干后放置于厌氧培养箱中，37 ℃，24 h后，进行菌落计数，每个梯度的测定设立3个重复。用MRS肉汤培养基为空白对照，调零分光光度仪，测定菌悬液的D值，在波长600 nm处测定其吸光值，记录D值。pH采用Mettler Toledo Delta 320pH计测定。使用OriginProPorable9.0软件绘制生长曲线和发酵过程pH变化曲线。

1.4 乳酸杆菌产过氧化氢量的测定

将乳酸杆菌接种于10 mL MRS肉汤中，37 ℃厌氧培养24 h，取培养物以1%的接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h后取培养物，3 354g，4 ℃离心15 min，收集上清液。按照下列公式计算过氧化氢产量并进行统计分析。

菌液中H2O2量(mmol·L-1)=

1.5 乳酸杆菌耐酸性试验

菌液培养好后，按10%体积比分别接种在pH 6.0、5.0、4.0、3.0和2.0的MRS液体培养基中，37 ℃，厌氧培养24 h后，置于漩涡混合器上振荡15 s，吸取2 mL混合液于比色皿中，测定其D值，试验重复5次，以平均D值为纵坐标，以pH为横坐标绘制耐酸性曲线图。

1.6 乳酸杆菌耐热性试验

将2种不同来源的乳酸杆菌菌种连续活化3次，挑取单个菌落于 10 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h后，调整1×109cfu·mL-1，分别置于40、50、60、70、80 ℃水浴中处理20、40、60 min后取样100 μL，进行梯度稀释，涂布MRS平板，37 ℃，厌氧培养24 h，计数，统计细菌的菌落数并计算出存活率[(菌落数×10)/(1×109)]，并进行统计分析。

1.7 乳酸杆菌的抑菌性试验

将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌菌液分别取150 μL涂布TSA固体培养基。待其自然风干后，在固体培养基上放置牛津杯。取80 μL乳酸杆菌培养物上清液、未接种乳酸杆菌的MRS、pH3.5的乳酸、灭菌水分别加入牛津杯中。培养24 h，在平皿上测出抑菌圈的大小，进行统计分析。

1.8 乳酸杆菌药物敏感性试验

将MRS固体培养基倾斜，然后用移液器取150 μL菌液于培养基边缘缓慢滴下，使其自然流淌开，再用玻璃推棒轻轻地来回涂布几次，使其分散均匀，待其自然风干后，用灭菌后的无齿镊夹取药敏纸片，轻压紧贴于培养基表面，37 ℃，厌氧培养24 h，测量抑菌圈直径，根据测量结果，依照WS/T125—1999标准进行判断。

1.9 乳酸杆菌致病性分析

选取SPF级小鼠35只，体质量18～22 g，随机分为7个试验组，每个试验组5只小鼠，并对每只小鼠编号，注射前称量、记录，饲喂观察一周。分别用1 mL注射器抽取各菌株37 ℃，24 h厌氧培养物并调整菌液浓度为1×109cfu·mL-1，取菌悬液0.5 mL腹腔内注射。观察小鼠的精神状态及食欲情况并作记录，第7天后称取小鼠质量，并记录结果。

1.10 乳酸杆菌黏附性试验

在6孔细胞培养板的每个孔中分别加入无菌的细胞爬片、1 mL不含双抗和胎牛血清的DMEM细胞培养液和乳酸杆菌悬液，并轻轻晃动，使乳酸杆菌分散均匀。用封口胶将培养板两端封住后置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养2.5 h。轻轻吸干细胞培养液，用pH=7.4的PBS缓冲液洗涤3次，置于无菌操作台中，待其自然干燥后，加入适量甲醇溶液浸没玻片，固定10 min，采用革兰氏染色法对其进行染色，待其晾干后，在油镜下观察乳酸杆菌在Hela细胞上的黏附情况。

将200 μL细胞悬浮液接种于96孔板的孔中，待细胞长满单层时，吸出细胞培养液，加入200 μL乳酸杆菌悬浮液(无双抗和胎牛血清的DMEM)，37 ℃，5% CO2培养箱中培养2.5 h。吸出培养液并用DMEM-PBS缓冲液洗涤细胞3次，然后加入125 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37 ℃静置30 min。取100 μL细胞裂解溶液于900 μL生理盐水中进行梯度稀释至10-7，然后取10 μL点滴到MRS琼脂培养基上，37 ℃厌氧培养24 h，细菌计数，试验重复3次，以平均值和标准方差表示结果，并进行统计分析。

1.11 数据统计与分析

用SPSS 20.0软件对实验中获得的数据进行统计分析。采用单因素方差分析法中的q-检验进行95%水平上的多重比较，以分析差异显著性；并对部分数据进行主体间效应的检验。

2 结果与分析

2.1 乳酸杆菌的生长曲线

采用菌落计数和测定D值的方法测定了6株乳酸杆菌的生长曲线，并对其不同时期培养液的pH进行测定，结果分别如图1、2、3所示。6株乳酸杆菌的生长周期为24 h，对数生长期为2～11 h。

从图1可知，6株乳酸杆菌的生长曲线呈“S”型，在11 h处各株乳酸杆菌菌落数目达到最大值，且WAV02>WAV01>GPV03>GPV02>WAV03>GPV01。12 h开始，菌落数开始呈缓慢下降趋势。

由图2可知，整个培养过程D值均呈上升趋势，在4～15 h之间曲线上升趋势最明显。WAV01的D值在4～9 h之间上升速度高于其他5株菌，从10 h开始WAV01的D值均低于GPV01、GPV02、GPV03、WAV03，而高于WAV02。WAV02的D值及上升趋势均低于其他株。

X代表培养液中cfu·mL-1数值X represents the cfu·mL-1 value in medium图1 6株乳酸杆菌的菌落计数曲线Fig.1 Colony counts in culture media of 6 Lactobacillus strains

由图3可知，培养基的初始pH在6.25左右；2～15 h培养基的pH逐渐降低，15 h时各培养基pH趋于稳定，此时各培养液pH在3.3～4.1之间。15～30 h各培养液pH略有降低。

2.2 乳酸杆菌产过氧化氢量的测定

试验结果和统计分析结果表明，大熊猫源乳酸杆菌产过氧化氢的能力略低，大熊猫源各菌株GPV01、02、03菌株产H2O2的能力分别为8.99、8.91和10.25 mmol·L-1，而WAV01、02、03菌株产H2O2的能力分别为10.74、11.67和10.46 mmol·L-1，但各菌株产过氧化氢的能力无显著差异。

2.3 乳酸杆菌的耐酸性

由图4可知，当培养基的pH在5～6时，对乳酸杆菌的生长影响不大。随着培养基pH逐渐下降，乳酸杆菌存活率明显下降。各菌株接种在pH为2的培养基，培养24 h后，D值均比较小，生长均较差。当培养基pH为2～3时，GPV01、GPV02、WAV03的D值在0.2～0.4之间，特别是GPV02具有很好的酸耐受力。pH为3～4，各菌株的D值都明显上升，其中WAV03上升趋势最为明显。pH为 4～5，各菌株的D值上升趋势相对比较缓和。在5～6之间已经趋于稳定并达到最高值，由此可见，GPV01、GPV02、WAV03具有较好的耐酸性。

图3 6株乳酸杆菌培养液pH变化曲线图Fig.3 Broth pH curve of 6 Lactobacillus strains

图4 不同pH条件下6株乳酸杆菌菌株24 h增殖结果Fig.4 Acid tolerance test results of 6 Lactobacillus strains

2.4 乳酸杆菌的耐热性

由表1可知，大熊猫阴道源乳酸杆菌GPV01对温度的耐受性不超过50 ℃，而GPV02和GPV03对50 ℃的耐受性也很弱。人阴道源乳酸杆菌WAV01和WAV02对温度的耐受性高达70 ℃。WAV03对高温的耐受性在37～50 ℃，对60 ℃的耐受性很弱。方差分析结果显示，各菌株和温度的共同作用对存活率的影响差异显著(P=

0.000)。各菌株的耐热能力不同，WAV01和WAV02的耐热能力显著强于其他4株菌株，大熊猫源的3株乳酸杆菌的耐热能力显著低于人阴道源乳酸杆菌，但大熊猫源的3株乳酸杆菌的耐热能力没有显著差异。温度对6株乳酸杆菌的存活率有显著影响，40 ℃至80 ℃间，随着温度上升，6株菌的存活率显著降低，温度从40 ℃上升到50 ℃时，6株菌的存活率出现跳跃式下降。

2.5 乳酸杆菌抑菌性

通过对TSA培养基上乳酸杆菌上清液抑菌圈直径的测量和统计，其结果如表3所示。

多重比较结果显示，在抑菌能力方面，GPV01、GPV02、GPV03、WAV01、WAV02和WAV03之间无统计学上的显著差异，虽然对不同致病菌的抑制程度有所不同，但也未达到统计学意义上的显著差异。这6株乳酸杆菌对3种致病菌的抑制作用显著低于pH 3.5的乳酸。

2.6 乳酸杆菌药物敏感性

本次药敏试验选用了7类共13种抗生素对乳酸杆菌进行药物敏感性试验，结果显示，GPV01、GPV02、GPV03、WAV01、WAV02和WAV03均对多西环素、氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、阿莫西林敏感，对链霉素、氧氟沙星、庆大霉素、复方新诺明、环丙沙星、磺胺甲基异恶唑耐药。GPV01、GPV03、WAV01、WAV02对四环素敏感，GPV02对四环素敏感性处于中等，WAV03对四环素耐药。GPV02对利福平敏感，GPV01、WAV03对利福平耐药， GPV03、WAV01、WAV02对利福平的敏感性处于中等。

表1 6株乳酸杆菌经不同温度处理不同时间的存活率

Table 1 Survival rates of 6Lactobacillusat different temperature%

表2 菌株和温度对存活率的影响

Table 2 Effects of strain and temperature on survival rate

菌株Strain平均存活率Averagesurvivalrate/%温度Temperature/℃平均存活率Averagesurvivalrate/%WAV024523a409075aWAV014435a502711bWAV032265b601558cGPV03200bc70601dGPV021923bc80000eGPV011588c

同一列无相同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

In the same column， the values with no same lowercase letters indicated significant differences atP<0.05 level.

2.7 乳酸杆菌对小鼠的致病性试验

6组健康小鼠分别腹腔注射0.5 mL菌悬液，对照组小鼠注射等量生理盐水，饲喂1周后，实验组和对照组小鼠精神食欲正常，均没有出现其他临床症状，根据《中华人民共和国药典》，该6株乳酸杆菌对小鼠无致病性。

表3 6株乳酸杆菌上清液抑菌活性比较

Table 3 Bacteriostasis activity comparison of sixLactobacillussupernatants

同一行无相同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

In the same row， the values with no same lowercase letters indicated significant differences atP<0.05 level.SAU，Staphylococcusaureus;E.coli，Escherichiacoli; SS，Streptococcus.

表4 乳酸杆菌对7类13种抗生素的耐药性

Table 4 Drug resistance ofLactobacillus with 7 category， 13 kinds of antibiotics

R，耐药；I，中等；S，敏感。

R， Resistance; I， Intermediate; S， Sensitive.

2.8 乳酸杆菌对Hela细胞的黏附性

根据图5和表5可知，同种来源的不同乳酸杆菌的黏附能力不同，不同来源的同种乳酸杆菌的黏附能力也相差较大。人阴道源乳酸杆菌对Hela细胞的黏附能力显著高于大熊猫源乳酸杆菌。

革兰氏染色Gram staining图5 乳酸杆菌黏附Hela细胞的显微图(1000×)Fig.5 Adherence effect of 6 Lactobacillus strains to Hela cell (1000×)

表5 乳酸杆菌对Hela细胞的黏附

Table 5 Adherence effect of 6Lactobacillusto Hela cells

菌株Strain实验1Test1∗实验2Test2∗实验3Test3∗每个细胞黏附细菌数AdherenceLactobacillusnumberperHelacellWAV02415×105437×105462×1055475±240aWAV03248×105236×105304×1053283±370bGPV01224×105251×105219×1052892±176bWAV01195×105192×105179×1052358±087cGPV03151×105167×105133×1051879±174dGPV02056×105051×105057×105683±033e

*, Hela细胞数为8×103cells·孔-1。

*, The unmber of Hela Cells is 8×103cell·hole-1

3 讨论

3.1 乳酸杆菌产过氧化氢的作用

本试验结果表明，人阴道源乳酸杆菌WAV02产过氧化氢能力是6株乳酸杆菌中最强的。其中GPV02和WAV03均是植物乳酸杆菌，但二者产过氧化氢能力存在较大差异。这也证明了同种不同株乳酸杆菌产H2O2的能力不同[5]。目前对于乳酸杆菌产H2O2与其抑菌能力的关系研究结果不一。有研究认为乳酸杆菌产生的H2O2通过直接杀菌或凭借过氧化物酶的作用来发挥其抑制、杀伤其他细菌的功能，阴道分泌物中过氧化物酶，在卤素离子存在的情况下能使H2O2的杀菌能力明显增强[6]。周晓梅等[7]发现阴道中产高水平过氧化氢乳酸杆菌的存在与孕妇细菌性阴道病(bacterial vaginosis，BV)及后来的羊膜炎和早产的风险有负相关性。谢菲等[8]发现产H2O2的乳酸杆菌在防御孕妇阴道感染、降低不良妊娠结局发生率中起重要作用。Voltan等[9]研究发现卷曲乳酸杆菌M247分泌H2O2作为信号转导分子诱导PPAR-γ激活IEC，直接调节上皮细胞对炎症刺激的反应。Otero等[10]发现加氏乳酸杆菌CRL1421和CRL1412均能够通过产生H2O2来抑制奶牛阴道金黄色葡萄球菌的感染。但也有研究发现乳酸杆菌产生H2O2的能力与其抑菌作用的关系并不明显[11]，即该研究中的乳酸杆菌发挥其抑菌作用并不是因为其产H2O2的作用。本研究中大熊猫源乳酸杆菌产H2O2的能力不及人源乳酸杆菌，这是否影响大熊猫阴道环境及生育有待进一步研究。

3.2 乳酸杆菌的耐酸性

目前商品化的乳酸杆菌制剂主要是口服剂型和外用剂型。乳酸杆菌能否正常发挥其益生性作用，很大程度上取决于菌落是否能顺利通过胃的强酸性环境，到达相应的部位，从而发挥微生态调节功能[12]。Reid等[13]研究发现口服乳酸杆菌能够明显改善阴道内环境，乳酸杆菌数量明显增加。Millette等[14]发现乳酸杆菌的抗菌作用是由于产有机酸和在酸性条件下具有活性的蛋白质物质。另有报道证实从健康人的粪便中分离到的乳酸杆菌在pH为3～5时具有显著的抑菌活性，对多数细菌具有抑制作用，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌[15]。Lin等[16]报道了嗜酸乳酸杆菌在MRS肉汤中培养20 h，其培养液的pH下降到3.78，当培养液的pH被调到7.2时，其抗菌活性几乎可忽略不计。根据以上研究可知，不管是通过胃的酸性环境，还是发挥其抑菌功能均要求乳酸杆菌具有良好的耐酸性。综上可知，酸性环境是乳酸杆菌发挥抑菌活性的前提，同时强酸性环境对乳酸杆菌的生长也有抑制作用。本试验中的GPV01、GPV02、WAV03具有良好的耐酸性。

3.3 乳酸杆菌的耐热性

3株人阴道源乳酸杆菌耐热性强于3株大熊猫阴道源乳酸杆菌。不同来源的同种乳酸杆菌在相同培养条件下耐热性不一样。在乳酸菌使用过程中，不同的处理方式对乳酸菌的破坏程度不同。研究表明，在进行水浴的湿热条件下，乳酸菌受到的破坏程度远远大于在饲料中的情况[17]。王旭明等[18]从厌氧发酵的食物垃圾中分离到一株耐热乳酸菌，其生长的最高环境温度为52 ℃。乳酸菌能够耐受一定程度的高温，但是其耐热性是由菌株本身特性及处理工艺决定的[19]。干酪乳酸杆菌在45 ℃时生长无明显抑制作用，当温度升高到60 ℃时菌株呈现出热敏感性，不能生长[20]。大熊猫正常体温大约在35～36 ℃，因此3株大熊猫阴道乳酸杆菌在健康大熊猫体内能够较好地生长。

3.4 乳酸杆菌的抑菌活性

乳酸杆菌能够产生多种抗菌物质，如有机酸、过氧化氢、蛋白质物质(如细菌素、类细菌素)等物[20-21]。研究发现，乳酸杆菌的抗菌活性是因为产酸造成环境pH下降所致[22]。Millette等[14]也发现乳酸杆菌的抗菌作用是因为产有机酸和在酸性条件下具有活性的蛋白质物质。调节乳酸杆菌培养液上清液的pH至中性会使其抗菌活性下降甚至消失[23]。Lin等[16]研究发现嗜酸乳酸杆菌在MRS肉汤中培养20 h，其培养液的pH下降到3.78，当培养液的pH被调到7.2时，其抗菌活性几乎可忽略不计。Juarez Tomas等[24]发现从女性阴道分离到的嗜酸乳杆菌由于产乳酸而能够抑制大肠埃希菌的生长。另外，Cook等[25]报道了有机酸不仅对病原菌起屏障作用，同时在维持结肠健康方面也起到了至关重要的作用。本实验所选菌株对不同致病菌的抑制程度有所不同，但也未达到统计学意义上的显著差异。这6株乳酸杆菌对3种致病菌的抑制作用显著低于pH 3.5的乳酸。可见酸性条件是保证乳酸杆菌发挥抑菌功能的基础。

3.5 乳酸杆菌的药物敏感性

评价乳酸杆菌对药物敏感性具有非常重要的临床意义。有研究表明，益生菌与抗生素配伍使用能够提高动物的生产性能[26]。但抗生素不仅能够有效地抑制病原微生物，同时也会杀死正常的微生物[27]。本试验选择了7类13种较为常规的抗生素进行乳酸杆菌抗生素敏感性测定。结果表明，不同乳酸杆菌对抗生素的敏感性不同。在临床治疗中，应尽量避免选取乳酸杆菌敏感的抗生素。同时有研究表明，有些乳酸杆菌本身对抗生素不敏感，乳酸杆菌的耐药性除与质粒相关外，还与细菌的表型、环境以及来源等有关[27]。因此，在临床上使用益生菌与特定抗生素联合用药时，益生菌可能会受到一定的抑制作用，但其益生菌作用并不会完全丧失。故益生菌与抗生素配伍使用时需要恰当的配伍比例，可以通过增加益生菌的活菌数量，或者减少抗生素的使用量来达到二者的协同作用[28]。

3.6 乳酸杆菌的黏附性

乳酸杆菌对病原微生物的生物屏障作用，抗癌作用，增强机体免疫力，延缓机体衰老等生理功能都是通过其黏附于相应靶器官的上皮细胞表面，定植形成稳定的菌群发挥其益生作用[29]。黏附是乳酸杆菌发挥其生物屏障功能的第一步，乳酸杆菌与宿主细胞的黏附是其发挥生理作用的基本条件。目前对细菌黏附能力的评价无具体标准，主要通过计数法和视觉观察法来进行大致的评价。对于乳酸杆菌黏附能力强弱也并无相关标准。同种来源不同乳酸杆菌的黏附能力不同，同种不同来源乳酸杆菌的黏附能力也存在较大差异。

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(责任编辑卢福庄)

Study on biological characteristics ofLactobacillusfrom giant panda vagina

MA Xiaoping1; YANG Tianyi1; YU Yan1; ZHANG Zhihe2，*， WANG Chengdong3, GU Yu4，*

(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.ChengduResearchBaseofGiantPandaBreeding，Chengdu610000，China；3.ChinaConservationandResearchCenterfortheGiantPanda，Ya’an625000，China; 4.CollegeofLifeScience，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

In the present study， 3Lactobacillusstrains of giant panda vagina (LactobacillussalivariusGPV01，LactobacillusplantarumGPV02 andLactobacillussaerimneriGPV03) were used as experimental group， and 3Lactobacillusstrains of woman vagina (LactobacillusacidophilusWAV01，LactobacilluscrispatusWAV02 andLactobacillusplantarumWAV03) were used as control group to explore the difference of these strains in hydrogen peroxide production capacity， acid resistance， heat resistance， antibacterial activity， drug sensitivity and adhesiveness. It was shown thatL.acidophilusWAV01，L.crispatusWAV02 andL.plantarumWAV03 possessed higher H2O2-producing ability and heat-resistance thanL.salivariusGPV01，L.plantarumGPV02 andL.saerimneriGPV03 under the same culture condition.L.salivariusGPV01，L.plantarumGPV02 andL.plantarumWAV03 exhibited acid tolerance.Dvalues ofLactobacillussuspensions were all between 0.2 to 0.55 for these strains when the pH was between 2 to 3 in the culture medium， and among these strains，L.plantarumGPV02 showed the highestDvalue (D=0.55) under the above condition. Six culture supernatants of theLactobacillusstrains had different inhibitory effects onEscherichiacoli，StaphylococcusaureusandHemolyticstreptococcus. SixLactobacillusstrains showed weaker inhibition on three pathogenic bacteria than lactic acid (pH 3.5). SixLactobacillusstrains were highly sensitive to doxycycline， ampicillin， ceftriaxone， cefotaxime， amoxicillin， and were sensitive to tetracycline and rifampicin. SixLactobacillusstrains showed resistance to streptomycin， ofloxacin， gentamycin， selectrin， ciprofloxacin and sulfamethoxazole. SixLactobacillusstrains could stick on Hela， and the average adhesion number of GPV01， GPV03， WAV01 and WAV03 on each Hela cell was 18.8-32.8. WAV02 had the strongest adhesion ability (54.75±2.40)·cell-1， while GPV02 had the worst adhesion ability (6.83±0.33)·cell-1.

giant panda;Lactobacillus; biological characteristics

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.06

2016-07-25

国家科技支撑计划项目(2012BAC01B06)；四川省科技厅基础研究计划项目(2013JY0175)；大熊国际资金项目(AD1415)

马晓平(1976—)，男，土家族，重庆石柱人，博士，副教授，从事临床兽医学的教学科研工作。E-mail: mxp886@sina.com.cn

*通信作者，张志和，E-mail: pandaking1888@126.com；古玉，E-mail: guyu632@sicau.edu.cn

S857.2+2；S852.6

1004-1524(2017)07-1093-10

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1093-1102

马晓平，杨天意，俞演，等. 大熊猫阴道源乳酸杆菌生物学特性研究[J].浙江农业学报，2017，29(7): 1093-1102.