普伐他汀对2型糖尿病大鼠视网膜组织中MCP-1表达的影响

于玲菲，李婕，李丹，杨宁，宁宏

（中国医科大学附属第一医院眼科，沈阳 110001）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常见的微血管并发症之一，在发达国家已成为成年人失明的主要原因，其发生发展可能与某些生长因子有关。单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1） 是由内皮细胞、血管平滑肌细胞和单核细胞分泌的一种趋化因子，是作用于单核细胞的特异的强趋化蛋白。近年来MCP-1在DR发生发展中所起的作用日益受到重视［1］。普伐他汀是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryle-CoA，HMGCoA）还原酶抑制剂，临床上用于治疗脂代谢异常，它除了能降低胆固醇外，还能够抑制细胞外基质形成、抗氧化、抑制炎性反应、抑制胶原纤维增生，还可以改善血管内皮的屏障功能［2，3］。另有研究证实，普伐他汀对糖尿病肾病有治疗作用［4］。糖尿病肾病与DR同为糖尿病的微血管病变，因此，我们推测普伐他汀可能通过细胞因子的调控对DR的内皮细胞损害、细胞外基质积聚起改善作用。本研究通过观察普伐他汀对2型糖尿病大鼠视网膜组织中MCP-1表达的变化，探讨普伐他汀治疗或预防DR发生的新途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性Wistar大鼠，体质量180～200 g，购自辽宁中医药大学实验动物部。随机分为正常组、糖尿病组和普伐他汀治疗组3组。其中糖尿病组和普伐他汀治疗组大鼠以60 mg/kg一次性腹腔注射2%链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），使用前以 0.5 mmol/L 的枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液（pH4.5）配制。大鼠自由进食水。注射后48 h采尾血测血糖及尿糖，将血糖浓度＞16.7 mmol/L、尿糖阳性的Wistar大鼠定为糖尿病鼠［5］。

取成模糖尿病大鼠36只（包括糖尿病组和普伐他汀治疗组各18只），正常组大鼠18只。正常组和糖尿病组大鼠喂正常饲料，普伐他汀治疗组大鼠喂正常饲料的同时按100 mg·kg－1·d－1喂入普伐他汀［8］。喂养30周后处死全部大鼠，取出每只大鼠1眼的视网膜，立即置液氮中冻存，另1眼去除眼前节后置于25 ml/L戊二醛溶液，4℃固定2 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋。

1.2 主要试剂和仪器

普伐他汀片（默沙东公司）；链脲佐菌素（Sigma公司）；MCP-1多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（棕黄色）（武汉博士德公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；RT-PCR试剂盒（美国Invitrogen公司）；显微图像分析系统（UIC/ROPER/OLYMPUS，Metamorph/Coolsnafx/Ax70型）。

1.3 免疫组化SABC法检测各组视网膜组织中MCP-1的表达

每个石蜡标本制成5μm厚连续切片3张。1张行HE染色，1张做MCP-1免疫组化研究，另1张作为PBS取代MCP-1一抗的阴性对照。对照组标本切片作为正常对照。已知MCP-1染色阳性的膀胱癌组织切片作为阳性对照片。常规制备HE染色切片、MCP-1免疫组化染色切片。常温晾置3 d，每张切片随机选取视网膜后极部视野2个，40倍物镜下照像，转存入计算机，用Metamorph软件计算等大区域中MCP-1阳性面积百分比及吸光度值（阳性表达为细胞质呈棕黄色着色）。

1.4 常规RT-PCR和Real-time PCR检测MCP-1 mRNA的表达

将冻存标本机械匀浆后，采用异硫氢酸胍－酚－氯仿一步法提取标本中的总RNA。紫外分光光度计下测A260和A280值，其A值均>1.9。采用First-Strand cDNA 合成试剂盒（Amersham Biosciences，美国）合成cDNA，操作按试剂盒说明书进行：8μl（1 μg）总RNA溶液65℃孵育10 min，迅速冷却至0℃，再加入 DTT 溶液 1μl，Oligo（dt）18引物 1μl，First-Strand合成混合液5μl，37℃孵育60 min。

采用Real-time PCR法定量分析MCP-1 mRNA表达水平。引物及特异性探针序列由ABI公司（Applied Biosystems，美国）设计并合成。Real-time PCR扩增在ABIPrism 7000系统（Applied Biosystems）上进行。反应总体积25μl，含相当于150 ng总RNA的cDNA，1μmol/L各种上下游引物，1 U的Taq DNA聚合酶。扩增条件：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。以持家基因GAPDH作为内对照，以等量cDNA中MCP-1与GAPDH mRNA表达值的比值作为各自基因mRNA表达的定量值。GAPDH扩增采用TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents VICTM Prove试剂盒（Applied Biosystems，美国）。

同时采用常规PCR法检测MCP-1 mRNA表达。反应总体积为50μl。引物序列为：MCP-1，上游5′ATGCAGGTCTCTGTCACG 3′，下游 5′CTAGTTCT CTGTCATACT 3′；GAPDH，上游 5′TGAACGGGAAG CTCACTGG 3′，下游 5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′。扩增条件：GAPDH，94 ℃ 1 min，，62 ℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环；MCP-1，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72℃1 min，37个循环。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，照相。

1.5 统计学分析

应用SPSS13.0软件包对实验数据进行统计分析。数据用x±s表示，所有资料的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜组织中MCP-1的表达（图1）

MCP-1阳性表达主要为视网膜神经节细胞胞质呈棕黄色。与正常组相比，糖尿病组视网膜变薄，神经节细胞数目减少，而普伐他汀治疗组视网膜形态无明显改变。与正常组相比，糖尿病组MCP-1表达明显增强，A值明显增大，差异有统计学意义（P<0.05），而普伐他汀治疗组MCP-1表达稍有增强，A值差异无统计学意义（P>0.05）。普伐他汀治疗组MCP-1表达较糖尿病组减弱，A值降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 各组大鼠视网膜组织中MCP-1 mRNA的表达

图1 2型糖尿病大鼠视网膜组织中M C P-1免疫组化结果 ×40Fig.1 Expression of M C P-1 in the retina of rat model of type 2 diabetes×40

PCR结果（图2）显示，与正常对照组比较，糖尿病组视网膜组织中MCP-1 mRNA表达水平明显增高，而普伐他汀治疗组MCP-1 mRNA表达稍有增强。普伐他汀治疗组MCP-1 mRNA表达明显弱于糖尿病组。Real-time PCR结果（图3）显示，以MCP-1/GAPDH比值代表MCP-1 mRNA的相对表达量，与正常组相比，糖尿病组视网膜组织中MCP-1 mRNA表达量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；普伐他汀治疗组MCP-1 mRNA表达量与正常组相比稍有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），与糖尿病组相比明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

图2 M C P-1 m RNA在各组大鼠视网膜组织中的表达Fig.2 Expression of M C P-1 m RNA in rat retina in each group

图3 M C P-1 m RNA在各组大鼠视网膜组织中表达水平的定量分析Fig.3 Q uantitative analysis of the expression of M C P-1 m RNA in rat retina in each group

3 讨论

近年的研究发现，糖尿病视网膜病变（DR）的发生发展与某些生长因子的过度表达有关。被MCP-1趋化激活的单核细胞、巨噬细胞可产生转化生长因子β、肿瘤坏死因子，破坏血－视网膜屏障，提高视网膜血管通透性，刺激血管外基质过度增生，导致视网膜新生血管的产生［9］，促进DR的发生发展。因此，有效地抑制视网膜组织中MCP-1的表达，对预防和延缓DR发生、发展可能具有重要的作用。

本研究结果发现，糖尿病组大鼠视网膜组织较正常组变薄，神经节细胞减少，而普伐他汀治疗组视网膜形态与正常组相比无明显差别，这表明普伐他汀能够阻止糖尿病引起的视网膜神经节细胞数减少，进而阻止视网膜组织损伤。普伐他汀可以改变糖尿病鼠视网膜微血管，这在我们之前的研究中已经证实［8］。

本研究中免疫组化和RT-PCR检测结果均显示，糖尿病组大鼠视网膜组织中MCP-1的表达显著增高，与文献报道一致［1］，提示MCP-1参与了糖尿病鼠视网膜组织代谢，可能在DR的发生中起重要作用。其机制可能为长期的高血糖刺激视网膜组织中内皮细胞和单核细胞产生MCP-1，促进细胞外基质表达，损害视网膜；MCP-1同时诱导单核细胞、血管内皮细胞表达黏附因子，增加白细胞的黏附，导致内皮细胞损伤与坏死，血－视网膜屏障破坏，血管通透性增加，组织缺血、缺氧加重，新生血管形成［9］。另外，过度表达的黏附分子与白细胞共同作用，黏附于血管内皮细胞表面，形成小栓子，堵塞小血管，导致血管闭塞，发生进一步血管损伤［9］。

本研究还发现，普伐他汀治疗组大鼠视网膜组织中MCP-1的表达虽然比正常组稍有增强，但差异无统计学意义，与糖尿病组相比则明显减弱，提示普伐他汀能够抑制MCP-1的表达。因此我们不难推断普伐他汀可能是通过抑制DR发生的关键因子—MCP-1来实现对2型糖尿病大鼠视网膜病变的阻止作用的。

综上所述，普伐他汀可阻止2型糖尿病大鼠视网膜神经节细胞减少，抑制2型糖尿病大鼠视网膜组织MCP-1的表达。普伐他汀这一临床常用药在DR的预防及治疗上可能有广泛的应用前景，这仍有待于进一步的临床试验证实。

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