鱼肝油酸钠对回肠新膀胱粘液分泌的影响

范治璐,滕忠义,李卫平

(1.大连医科大学附属第二医院 泌尿外科,辽宁 大连 116027;2.大连医科大学 08级硕士研究生,辽宁 大连 116044;3.大连医科大学 药学院,辽宁大连 116044)

鱼肝油酸钠对回肠新膀胱粘液分泌的影响

范治璐1,滕忠义2,李卫平3

(1.大连医科大学附属第二医院 泌尿外科,辽宁 大连 116027;2.大连医科大学 08级硕士研究生,辽宁 大连 116044;3.大连医科大学 药学院,辽宁大连 116044)

[目的]了解鱼肝油酸钠和酒精对回肠新膀胱黏膜和杯状细胞分泌功能的影响。[方法]SD大鼠 24只,体重250g,随机分为生理盐水对照组(A组)、75%酒精组(B组)、鱼肝油酸钠组(C组),每组 8只。大鼠回肠新膀胱模型建立后,分别第 8、11、14天新膀胱灌药,每次灌药后 72 h留取尿液,测定尿液蛋白浓度;第 17天处死大鼠,取新膀胱标本,光镜和电镜观察形态变化,免疫组化方法检测NF-кB表达,以评估新膀胱黏膜状况及粘液分泌情况。[结果]与 A组新膀胱尿液中蛋白浓度(4.48±0.56)mg/m L相比,B组(1.21±0.07)mg/mL、C组(1.69±0.36)mg/mL均显著降低(P＜0.05);光镜下,A组新膀胱肠绒毛整齐,黏膜完整,肌层未见损伤,杯状细胞所占比例：(0.31±0.03)/HP;B组新膀胱肠绒毛结构紊乱,黏膜不完整,肌层有不同程度损伤,杯状细胞所占比例(0.08±0.04)/HP,低于 A组。C组新膀胱肠绒毛无明显异常,黏膜及肌层无明显损伤,杯状细胞所占比例(0.12±0.05)/HP,较 A组降低;核因子 NF-кB阳性表达细胞数为：A组(27.88±7.18)、B组(7.50±2.20)、C组(11.88±2.61),后二组均显著降低(P＜0.05);电镜下,A组新膀胱肠黏膜微绒毛整齐,细胞器正常;B组无微绒毛结构,大量细胞液化坏死,颗粒释放;C组微绒毛变短、稀疏或缺失,细胞器基本正常。[结论]鱼肝油酸钠较 75%酒精更适合应用于术后灌注回肠新膀胱。

回肠新膀胱;鱼肝油酸钠;组织损伤

目前,根治性膀胱切除术已经成为肌层浸润性膀胱癌,高危或者反复复发的非肌层浸润性膀胱癌治疗的金标准[1,2],治愈率远高于其他方法。膀胱全切后的尿流改道方案对患者的预后和生活质量有着重要意义,自 1852年 Simon报道输尿管直肠吻合以来,回肠、空肠和结肠都作为尿流改道的选择,并在临床中得到应用和发展。近十多年以来,原位新膀胱手术得到迅速发展,因为其功能更接近于生理性膀胱,在条件允许的情况下回肠新膀胱术已成为尿流改道的首选术式[3],但是新膀胱中的肠黏膜仍然存在分泌和吸收功能,会引起一系列的并发症,如电解质紊乱、尿路堵塞、残余尿增多、结石形成、尿路感染等。本实验尝试通过鱼肝油酸钠和 75%乙醇灌注回肠新膀胱,使其黏膜的分泌功能减退或消失,从而减少并发症的发生机会。

1 材料和方法

1.1 实验动物、材料和设备

1.1.1 实验动物：健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠24只,体重 200～250 g,由大连医科大学实验动物中心提供,许可证号 SCXK(辽)2008-0002。

1.1.2 主要实验试剂及仪器：鱼肝油酸钠注射液(上海东海制药股份有限公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物制药工程公司),免疫组化试剂盒,DAB显色试剂盒,HE染色试剂(大连医科大学病理实验室提供),小鼠抗大鼠 NF-кB多克隆抗体(分装 Santan Cruz Biotechnology)。实验操作台、手术器械、酶标仪(大连医科大学药理学实验室提供),微量电子秤 FA1104(上海精科天平)。

1.2 实验方法

1.2.1实验动物分组：实验动物随机分为 3组,每组8只 。 0.9%NaCl组(A组 )、75%酒精组(B组 )、鱼肝油酸钠组(C组)。

1.2.2 实验过程：取下腹正中切口长约 2.5 cm,显露腹腔,寻及回盲部及膀胱。距回盲部近端 5～7 cm处截取一段长约 4 cm的回肠,保留其血管蒂,暂时用生理盐水纱布外敷保护。以 5～0慕丝线行小肠端端吻合,恢复其连续性。吻合完毕后将其还纳于腹腔。游离小肠段以庆大霉素冲洗 30 s,两端分别以 5～0丝线行间断缝合。于其肠系膜对侧,与肠管平行剪开一长约 1 cm弧形开口,距膀胱三角区0.3 cm切除膀胱,注意勿伤及输尿管及输尿管口。膀胱残端与新膀胱以 5～0可丝线线间断吻合,查无活动性出血后逐层关闭腹部切口。术后抗感染治疗3 d。

1.2.3 给药：模型建立后的第 8、11、14天向 A组大鼠代膀胱注入生理盐水 1m L;向 B组注入 75%酒精1m L;向 C组注入鱼肝油酸钠(5 mg/m L)1 mL。A、C组每次保留 2 h,每隔 30 min更换体位 1次,B组灌注 1min后抽出。

1.3 标本采集与指标测定

1.3.1 标本采集：每次膀胱注药 72 h后,留取尿液标本。第 17天处死大鼠,取代膀胱组织,分别用4%中性甲醛固定及 2.5%戊二醛固定,常规石蜡包埋。

1.3.2 指标测定：组织形态学观察及杯状细胞计数;常规 HE染色,组织形态学观察：解剖显微镜观察回肠新膀胱黏膜层及黏膜下层的组织结构变化情况。采用回肠黏膜评分判定肠黏膜损伤情况：0分：肠组织正常无坏死;1分：轻度肠上皮脱落,仅限于黏膜顶部;2分：绒毛坏死,局限于顶部;3分：绒毛中度坏死,肠隐窝清晰可见;4分：绒毛完全坏死。杯状细胞计数：每例标本随机选取 5个绒毛,计数每百个细胞中杯状细胞所占比例,取平均值。电镜观察：观察杯状细胞形态及结构变化,各细胞器的变化情况。核因子 NF-кB免疫组化染色：按说明书用SABC法进行免疫组织化学染色。每例观察切片 1张,随机选取 5个非重叠的视野进行观察计数,计算视野内阳性表达细胞数,取平均值。尿蛋白测定。

1.4 统计学方法

应用 SPSS 16.0统计软件处理数据,计量资料以均数 ±标准差(±s)表示,两组间均数比较采用 t检验,多样本均数比较的单因素方差分析(One-Way ANONA)法进行检验,多组连续变量资料采取秩和检验(Kruskal-Wallis Test),取 a=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 新膀胱组织形态学方面

C组 HE染色光镜下可见新膀胱组织轻度炎症性反应,黏膜杯状细胞数量减少,组织黏膜及黏膜下层无明显损伤,与 A组黏膜组织比较差异无显著性意义;B组肠绒毛结构紊乱,黏膜层不完整,固有层及肌层均有不同程度的损伤,炎症细胞聚集,与 A组差异有显著性意义(表 3,图 1)。

2.2 药物对杯状细胞分泌粘液的影响

与 A组新膀胱尿液中的尿蛋白浓度(4.48±0.56)mg/m L相比,B组(1.21±0.07)mg/m L、C组(1.69±0.36)mg/mL均明显降低,差异具有显著性意义;B组尿蛋白浓度低于 C组,差别具有显著性意义(P＜0.05)(表 1)。

2.3 药物对回肠杯状细胞数目的影响

C组(0.12±0.05)、B组(0.08±0.04)每高倍视野杯状细胞所占比例均低于 A组(0.31±0.03),差异具有显著性意义(P＜0.05)。B、C组之间差异无显著性意义(表 2)。

2.4 电镜观察情况

A组肠黏膜结构完整,表面微绒毛整齐,杯状细胞轻微胀大,内充满了分泌颗粒。C组细胞器基本正常,细胞内粘液较对照组减少。B组少见杯状细胞,偶有发现杯状细胞液化坏死,颗粒释放,黏膜结构破坏严重(图 3)。

2.5 核因子 NF-кB免疫组化染色阳性表达细胞数

与 A组(27.88±7.18)相比,C组(11.88±2.61)、B组(7.50±2.20)阳性细胞数均明显降低,差别具有显著性意义(P＜0.05)。B组阳性细胞数少于 C组,差别有显著性意义(表 2,图 2)。

表 1 药物对回肠新膀胱中蛋白含量的影响Tab 1 In fluence of durgs on density ofmucus in neo-bladder

表 2 药物对回肠杯状细胞数目的影响Tab 2 Influence of durgs on the number of goblet cells

表 3 回肠黏膜评分Tab 3Score of the ileum mucousmembrane

图1 回肠新膀胱组织的HE染色Fig 1 HE coloretur of Neo-b ladder

图2 NF-кB免疫组化染色Fig 2NF-кB immunohistochem isty

图3 电镜观察Fig 3Electron microscopy

3 讨 论

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤。膀胱全切、回肠代膀胱术是治疗浸润性膀胱癌有效的手术方法[1],该术式可使患者术后从原尿道自行排尿,排尿方式与正常人相同,从而提高了患者术后的生活质量。然而,由于术后代膀胱不断分泌肠粘液,容易造成代膀胱引流管的堵塞和尿液排出不畅,导致并发症发生。此外,代膀胱的堵塞还可使输尿管尿液排出受阻,引发肾积水。虽然术后随着时间的推移,肠管上皮逐渐膀胱化,粘液量会逐渐减少,黏膜的分泌功能逐渐减弱[2],但此变化出现一般需要1年[3]甚至更长的时间,而术后早期粘液分泌引发的问题并没有得到解决。因此,积极抑制肠黏膜粘液分泌十分必要。目前文献报道处理肠黏膜的方法有很多种,如机械性剥离肠黏膜[4,5],光动力法[6],酶处理法[7],但多在动物水平,且费用昂贵。应用化学试剂处理灭活肠黏膜具有简单、方便、经济的特点,有临床应用前景。目前,临床上采用无水酒精法处理[8,9],副作用较大,损伤肠壁为不可逆性,导致肠膀胱功能受损。处理时间也无统一标准。本实验采用鱼肝油酸钠处理回肠新膀胱黏膜,希望能达到既能使新膀胱黏膜减少粘液分泌,又不影响新膀胱生理功能的目的。

鱼肝油酸钠(Sodium Morrhuate)是中国与美国目前都广泛使用的一种海洋药物。作为硬化药,鱼肝油酸钠早年主要是用于下肢静脉曲张的治疗以及血管瘤[10]、内痔[11]的治疗等。其机制主要为：当药物注入血管内、血管周围、囊肿腔及体腔内时,由于化学性炎症而产生血管内膜、囊肿内膜、浆膜的破坏而相互粘连,借以闭塞管腔或产生组织纤维化,以达到治疗目的。除了作为硬化药,鱼肝油酸钠同时也作为止血药以及辅助抗肿瘤药物应用。鱼肝油酸钠用于止血,是其新用途研究中的一个发现,已广泛用于体表、体腔、脏器的渗血性出血及手术创面出血的止血。其止血的作用机制是：(1)鱼肝油酸钠诱导血小板凝集。(2)鱼肝油酸钠能激活内源凝血系统。(3)鱼肝油酸钠阻断了微循环。(4)鱼肝油酸钠病灶基底部注射止血与硬化压迫治疗(Sclero-Pressure Therapy)机制有关[12]。与硬化剂止血作用相比较,鱼肝油酸钠在恶性肿瘤治疗方面的应用尚未引起重视,1987年,李彦豪[13]经动物实验首次证明了 5%鱼肝油酸钠是一种有效的动脉栓塞剂可用于肝动脉栓塞治疗原发性肝癌,1997年,刘利民等[14]应用超声引导下鱼肝油酸钠乙醇混合液(SMPA)瘤内直接注射治疗肝癌,较单纯乙醇注射组(PAI)对肿瘤细胞的杀灭力强,并认为鱼肝油酸钠具有改变细胞内外环境,并调节局部免疫功能的作用。崔立刚等[15]研究发现鱼肝油酸钠瘤内注射具有显著的抗肿瘤治疗效果。动物实验研究表明[16],鱼肝油酸钠可使肿瘤组织局部发生无菌性炎症坏死,粒细胞增多。而大量巨噬细胞的出现,从另一方面说明了鱼肝油酸钠对肿瘤的杀伤作用。其机理为：(1)对局部的肿瘤细胞起到了杀伤作用。(2)鱼肝油酸钠被肿瘤细胞吞噬后,破坏了肿瘤细胞的内环境,使肿瘤细胞不能生长繁殖以至坏死。(3)鱼肝油酸钠可破坏肿瘤组织血管,从而使肿瘤的血液供应发生障碍,使肿瘤细胞营养不良,生长缓慢,并发生坏死。鱼肝油酸钠的硬化、止血及抗肿瘤作用,对行回肠新膀胱术患者有着积极的治疗作用,作为止血药,可以减少新膀胱手术缝合区出血;作为硬化药,又可以硬化新膀胱黏膜,减少粘液分泌;作为抗肿瘤药,则对减少膀胱癌复发有帮助。所以本实验选择鱼肝油酸钠作为回肠新膀胱术后膀胱灌注药物,以求能减少术后并发症。同时,在同等时间条件下与 75%酒精组比较处理效果。

在本实验中,应用鱼肝油酸钠灌注大鼠回肠新膀胱,与 75%酒精灌注大鼠回肠新膀胱进行比较。通过 HE染色观察发现：75%酒精组肠绒毛结构紊乱,黏膜层不完整,固有层及肌层均有不同程度的损伤,炎症细胞聚集,不适合做为膀胱灌注药物。而鱼肝油酸钠高剂量组和低剂量组组织黏膜及黏膜下层无明显损伤,与对照组差异无显著性意义。通过测定尿液中尿蛋白含量,发现鱼肝油酸钠高、低剂量组回肠新膀胱尿液中蛋白浓度显著减低。尿液的粘度显著下降,对减轻患者的术后并发症,提高其生活质量有积极的作用。电镜观察发现：对照组肠黏膜结构完整,表面微绒毛整齐,杯状细胞轻微胀大,内部充满了分泌颗粒。鱼肝油酸钠低、高剂量组细胞器基本正常,细胞内粘液较对照组减少。75%酒精组少见杯状细胞,偶有发现杯状细胞液化坏死,颗粒释放,黏膜结构破坏严重。实验结果表明在既能减少粘液分泌,又不损害新膀胱功能前提下,应用鱼肝油酸钠灌注膀胱要比 75%酒精更适合。

实验还发现：鱼肝油酸钠高、低剂量组大鼠的NF-кB入核率较对照组明显降低(图 5,6,7)。据文献报道：在静息状态下,细胞中 NF-KB存在于胞浆中,被激活后 NF-κB将移入核内,与 MUC5AC启动子近侧的核转录因子 -κB结合位点结合,激活转录因子,启动子活化,引起 MUC5AC基因转录、蛋白表达增多[17]。徐治波,游明元等[18]发现 NF-κB的活化与粘蛋白 Muc5ac的表达呈正相关。欧雪梅等[19]在大环内酯类抗生素对气道粘液分泌影响的研究中也发现,罗红霉素对气道粘液高分泌的调控作用,其分子机制与核因子 NF-KB的活动有关。本实验结果与相关文献报道相一致。由此可以推测回肠新膀胱粘液分泌减少,与肠柱状粘液上皮细胞核因子 NF-кB的表达受抑制具有相关性。

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Influence of soduim morrhuate onm ucus production of neo-bladder of rats

FAN Zhi-lu1,TENG Zhong-yi2,LIWei-ping3
(1.Department of Urinary Surgery,the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116027;2.Da lian Medical University Student at Grade 2008,Dalian 116044,China;3.Pharmaceutical College,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

[Objective]To investigate the effects ofmorrhate sodium and 75%alcohol on the intestinalmucosa and goblet cells of neo-bladder in ratmodel.[Methods]SD rats of 24 weighing about 250 gramswere randomly divided into saline(A),morrhate sodium(B),and 75%alcohol(C)groups.The d rugswere injected to the neo-bladders at the 8 th,11 th,and 14 th day after the operation of neo-bladder reformation from ileum,and the urine in neo-b ladderwere collected at72 hours following drug injection.The rats were terminated at the 17 th day.The neo-bladder tissueswere observed under the lightmicroscopy and electron microscopy,and NF-кB expression in the tissues were detected by immunohistochemisty for comparing the degree of in jury.[Results]Protein concentrations of group A were(4.48±0.56)mg/mL,group B were(1.21±0.07)mg/mL,and group C were(1.69±0.36)mg/mL,respectively(P＜0.05).Microscopy,in group A,the intestinalmucosa was comp lete and intestinal villus was regular,muscu lar layer in jury was not clear,the proportion of goblet cellswas(0.31±0.03)/HP,in group B,the intestinalmucosa was not complete,and intestinal villus was disorder,the muscu lar layer have different degrees of damage,the p roportion of goblet cellswas(0.08±0.04)/HP,and in group C,the intestinalmucosa and muscular layer had a few of injury,the p roportion of goblet cellswas(0.12±0.05)/HP.The number of NF-кB positive cellswere(27.88±7.18)in group A,(7.50±2.20)in group B,and(11.88±2.61)in group C,respectively(P＜0.05).Under electronmicroscopy,in group A：the structure ofm icrovilliwere comp lete,organelle injury was not clear.In Group B：microvilliwerenot completeand cytoplasma werenot clear.And in group C：m icrovillibecame smaller and organelles injury was not clear.[Conclusion]Themorrhate sodium is more suitable for irrigation of bladder of Neobladder than the alcohol.

neo-b ladder;Morrhate Sodium;injury

R 737.14

A

1671-7295(2011)01-0040-06

2010-11-11;

2010-12-29

范治璐(1955-),男,湖北武汉人,教授。