MOG抗原诱导的自身免疫性脑脊髓炎模型的建立及组织蛋白酶抑制剂 cystatin F的表达

高文婷,范 凯,李 宁,马坚妹

(1.大连医科大学实验动物中心,辽宁大连 116044;2.大连医科大学解剖学教研室,辽宁 大连 116044)

MOG抗原诱导的自身免疫性脑脊髓炎模型的建立及组织蛋白酶抑制剂 cystatin F的表达

高文婷1,范 凯2,李 宁2,马坚妹2

(1.大连医科大学实验动物中心,辽宁大连 116044;2.大连医科大学解剖学教研室,辽宁 大连 116044)

[目的]研究组织蛋白酶抑制剂cystatin F在少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55诱导的自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中的表达。[方法]利用 MOG 35-55建立 EAE模型,通过行为学观察对其进行神经功能评分;利用免疫组织化学方法证明髓鞘脱失情况;通过连续切片分析,及原位杂交和免疫组化技术对小胶质细胞活化和 cystatin F的表达进行研究。[结果]利用 MOG 35-55可成功制备EAE模型;cystatin F在正常小鼠中枢神经系统内没有表达,但在脱髓斑块周围可见其表达。通过系列连续切片分析,其表达与在脱髓斑块周围积聚的小胶质细胞具有高度的一致性。[结论]cystatin F在MOG诱导的 EAE中具有表达,其表达与积聚的小胶质细胞具有高度的一致性。

自身免疫性脑脊髓炎模型;脱髓鞘;cystatin F;小胶质细胞

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是发生于中枢神经系统的自身免疫疾病,即自身免疫系统攻击包裹在神经轴突表面髓鞘所导致的脱髓鞘疾病[1]。临床上以中、青年多见,病灶播散广泛,其症状有赖于中枢神经系统受累的部位,以视神经损害最为多见,病程中常出现缓解/复发交替。其主要病理改变为炎性细胞浸润、髓鞘脱失,以及髓鞘脱失后由于胶质细胞增生而形成的硬化斑。MS属于神经系统的难治性疾病,现有的各种治疗手段仅能起到延缓并不能阻止疾病发展。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)与人类 MS的发病机制和病理变化极其相似,是研究MS较理想的动物模型[2]。EAE动物模型常用的致敏原多为脑或脊髓组织匀浆、髓鞘蛋白成分或其多肽片段等,其中髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycop rotein,MOG)所导致的 EAE模型免疫源性高,因更能模仿人类 MS疾病过程而备受青睐[3]。

髓鞘再生一直以来被视为治疗 MS最有前途的策略。髓鞘脱失过程伴有的多种神经病理学改变中,以小胶质细胞和星形胶质细胞活化最为常见,它们可以通过表达各种蛋白或细胞因子影响髓鞘再生的微环境。因此,髓鞘再生微环境的变化,即某些基因表达水平的变化,对脱髓鞘疾病具有重要影响。对此类基因的研究有助于髓鞘再生机制的阐明,对于开发 MS治疗性药物具有深远意义。

本研究以MOG35-55多肽作为抗原物质,利用C57BL/6小鼠制备 EAE模型,通过临床评分和神经病理学研究证实模型成功、可靠,同时针对病灶内组织蛋白酶抑制剂 cystatin F的表达进行了分析。

1 材料和方法

1.1 材 料

SPF级 C57BL/6小鼠雌雄不拘,体重 18～20 g,25只,购自大连医科大学实验动物中心。20只用于制备 EAE模型,具体过程为：将 150μg MOG35-55多肽(序列为 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,Auspep,Melbourne,Australia)溶解于含有 4mg/m L热灭活结核分支杆菌(Sigma)的完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA),注射于小鼠背部脊柱两侧,分 4点皮下注射 (每只约 0.12 mL),之后立刻于腹腔内注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)400 ng,48 h后再注射 1次。其余 5只作为对照组给予正常饲育。

1.2 方 法

1.2.1 神经功能评分：自免疫当天开始每日称小鼠体重并观察小鼠的精神情况。神经功能评分方法：0分：无症状;1分：鼠尾张力障碍;2分：鼠尾张力障碍并且后肢力弱;3分：后肢部分瘫痪;4分：后肢完全瘫痪;5分：濒死状态或死亡。

1.2.2 组织取材：随机选取免疫后第 23天 EAE小鼠 5只和正常对照组小鼠,乙醚麻醉后,剪开胸腔,充分暴露心脏,快速心内插管,经左心室灌注 4%多聚甲醛约 30 mL后取脑和脊髓;于 4%多聚甲醛 4℃中固定过夜,20%蔗糖置换,OCT包埋后,于冷冻切片机 18μm矢状切片用于免疫组化和原位杂交。

1.2.3 免疫组化 ABC：利用免疫组化 ABC法检测髓鞘碱性蛋白(Myelin Basic Protein,MBP)和 Iba1表达,以确定脱髓和小胶质细胞活化状态。主要步骤包括：0.3%的过氧化氢溶液 30min消除内源性过氧化物酶的影响;0.3%Triton×100(30%Triton×100+0.01mol/L PBS 100 mL)30 min增加细胞的通透性;加入一抗室温过夜;加入生物素标记的二抗室温孵育 2 h;加入 ABC复合物室温孵育 2 h;二甲基联苯胺显色;梯度酒精脱水之后,封片,拍照。

1.2.4 原位杂交检测 c-fms表达：切片经 4%多聚甲醛溶液固定 20 min,20μg/mL蛋白酶 K处理30min;4%多聚甲醛溶液固定 15 min,以灭活蛋白酶 K;0.1MTEA(三乙醇胺)-HCL洗 15 min;65℃预杂交 2 h后,分别加入杂交液(地高辛标记的 cfms探针)65℃过夜;缓冲液(1×SSC和 50%甲酰胺)65℃洗 30 min×3;MABT缓冲液(100 mmol/L maleic acid,150 mmol/L NaCl,0.1%Tween-20,pH 7.5)室温洗 30 min×2;加碱性磷酸酶耦联的抗地高辛抗体,4℃过夜;MABT缓冲液洗室温 30 min×3;NBT/BCIP室温孵育至呈色良好;PBS终止反应。杂交后的切片用 Nuclear Fast Red衬染。

2 结 果

2.1 小鼠发病率及神经功能评分

EAE模型小鼠的发病率为 100%,2只小鼠发病急剧,于免疫后 8 d之内死亡。动物普遍在免疫后第 2天即出现尾张力弱症状,第 5天评分达到高峰,之后开始出现缓解,15 d后症状基本稳定在 2～3分左右,一直持续至第 40天(图 1)。

2.2 小鼠中枢神经系统髓鞘脱失及小胶质细胞活化情况

图1 MOG诱导C57BL/6小鼠EAE的临床过程及评分Fig 1 Clinical course ofMOG induced EAE in C57BL/6m ice(n=18)

MBP免疫组化结果显示,正常小鼠小脑中央白质和小脑叶间白质均可见均匀一致的髓鞘染色(图2A),MOG免疫后 23 d EAE小鼠可在脑内见到斑块状的髓鞘脱失区域(图 2B箭头所示区域)。c-fms基因编码的跨膜糖蛋白为单核细胞集落刺激因子CSF-1受体的类似物,其表达主要在单核细胞系的细胞中,包括脑内的小胶质细胞,可以作为脑内单核吞噬/小胶质细胞的标志物。正常动物的小脑内可见少量、均匀的 c-fms阳性细胞存在(图 2C),MOG免疫后可见 c-fms阳性单核吞噬/小胶质细胞积聚于脑内白质区域,如小脑中央白质、小脑叶间白质(图 2D)和胼胝体白质内(图 2E、F),部分集中在血管的周围(图 2E、F)。

2.3 组织蛋白酶抑制剂 F在 EAE模型中的表达

图2 MOG诱导的EAE小鼠免疫后 23 d的神经病理学改变A和 C取自正常小鼠,B以及 D～F为 EAE模型小鼠。A～B为 MBP免疫组化染色;C～D为 c-fms原位杂交结果。E图中的矩形区域被扩大为 F图。标尺：A～E标尺为 100μm;F标尺为 50μmFig 2The neuropathological changes in EAEm ice after immunized by MOG for 23 daysA and C are from untreated mice;B,D～Fwere from EAEmice.A～B show the MBP IHC staining;C～D show the c-fms ISH,the rectangle in E is enlarged in F.Scale bar：100 μm in A～E;50μm in F

Cystatin F在正常对照组动物中无表达 (图3C),在EAE动物模型中表达,表达的部位主要位于硬化斑周围部(图 3D)。连续切片研究结果显示(n=5)cystatin F表达区域(图 3D)与硬化斑块周边部的活化小胶质细胞的分布区域具有高度一致性(图 3A～B)。

图3 Cystatin F表达与小胶质细胞积聚的关系A～B,D取自 EAE小鼠连续切片,A为 Iba-1免疫组化,B为 c-fms原位杂交,D为 cystatin F原位杂交。C取自正常对照小鼠的 cystatin F原位杂交结果。标尺为 50μmFig 3 The relationship between the expression of cystatin F and the accumulation ofmacrophage/micrglia cellsA～B show the Iba1 IHC and c-fms ISH in EAEmice,respectively.C～D show the cystatin F ISH.C is from untreated mice,D is from EAE mice.Scale bar：50μm in A～D

3 讨 论

MS是神经系统的难治性疾病。目前,关于此疾病的研究主要利用动物模型,其中 EAE模型在发病机制和病理过程中均可最好的模仿 MS。制备 EAE可以采用多种抗原,如脑或脊髓组织匀浆、髓鞘蛋白成分或其多肽片段等。本研究采用的 MOG是位于髓鞘及少突胶质细胞最表面的糖蛋白,有两个跨膜区域。与其它髓鞘蛋白成分相比,如髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP),髓鞘蛋白脂质蛋白(proteolipid protein,PLP)等因具有免疫源性高、可诱导产生抗 MOG的 T淋巴细胞等特点而倍受青睐[3]。MOG既可以用于制备小鼠 EAE模型,也可用于制备大鼠的 EAE模型。其中,小鼠模型中以C57BL/6最为易感,并且没有动物性别间的差异性[4],病程呈慢性持续状态,非常适合进行髓鞘脱失及再生机制的研究。本研究发现,免疫后小鼠中枢神经系统白质内可见多个髓鞘脱失区域,同时可见 Iba1和 c-fms阳性单核吞噬/小胶质细胞的集聚,其中一些出现在血管周围,呈典型的袖套状外观。

Cystatin F发现于 1993年,别名 Leukocystatin和CMAP(cystatin-likemetastasis associated protein),属于Ⅱ型半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员。Cystatin F的表达主要见于淋巴器官,如脾脏,淋巴结等,主要存在于与抗原呈递相关的细胞中。在某些肿瘤细胞,如白血病细胞中也有表达[5,6],有研究证明 Cystatin F在肿瘤细胞中的表达与肿瘤的转移有一定的相关性[7,8]。本组先前的研究发现,Cystatin F不表达于正常小鼠中枢神经系统内,但表达在 cuprizone诱导的髓鞘脱失模型中,并且通过原位杂交后组化研究确定了表达细胞主要为单核吞噬/小胶质细胞[9]。然而 cuprizone是铜离子的螯合剂,是通过对少突胶质细胞的毒性导致脱髓鞘改变的发生,与 EAE通过自身免疫机制诱发髓鞘脱失从诱发机制上具有一定的区别,因此,由 MOG诱导的 EAE模型中是否同样具有 cystatin F的表达还是个未知数。通过本研究证实,cystatin F同样表达在 EAE模型中,并且其表达主要位于髓鞘脱失灶的周围,并且通过连续切片研究发现,cystatin F表达区域与 Iba1和c-fms阳性单核吞噬/小胶质细胞具有很强的一致性。小胶质细胞的集聚与崩解髓鞘的吞噬作用有关,那么 cystatin F在小胶质细胞内的表达是否由髓鞘吞噬所诱导还需进一步证实。

Cystatin F基因在正常小鼠中枢神经系统内无表达,但表达于 MOG诱导的 EAE模型中;其表达部位与小胶质细胞积聚部位具有高度的一致性,提示cystatin F表达与单核吞噬/小胶质细胞对崩解髓鞘的吞噬有关。

[1]Steinman L.Mu ltiple sclerosis：a coordinated immunological attack against myelin in the central nervous system[J].Cell,1996,85：299-302.

[2]Bebo BF Jr,Schuster JC,Vandenbark AA,et al.Gender differences in experimental autoimmune encephalomyelitis develop during the induction of the immune response to encephalitogenic peptides[J].NeurosciRes,1998,52：420-426.

[3]Bernard CC,Johns TG,Slavin A,et al.Myelin oligodendrocyte glycoprotein：a novel candidate autoantigen in multiple sclerosis[J].JMolMed,1997,75(2)：77-88.

[4]Okuda Y,Okuda M,Bernard CC.Gender does not influence the susceptibility of C57BL/6 mice to develop chronic experimental autoimmune encephalomyelitis induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein[J].Immunol Lett,2002,81(1)：25-29.

[5]Halfon S,Ford J,Foster J,etal.Leukocystatin,a new Class II cystatin expressed selectively by hematopoietic cells[J].JBiol Chem,1998,273(26)：16400-16408.

[6]Cappello F,GattiE,Camossetto V,etal.Cystatin F is secreted,butartificialmodification of its C-term inus can induce its endocytic targeting[J].Exp Cell Res,2004,297(2)：607-618.

[7]Nathanson CM,Wasselius J,Wallin H,et al.Regu lated expression and intracellular localization of cystatin F in human U 937 cells[J].Eur J Biochem,2002,269(22)：5502-5511.

[8]Langerholc T,Zavasnik-Bergant V,Turk B,et al.Inhibitory properties of cystatin F and its localization in U 937 promonocyte cells[J].FEBS J,2005,272(6)：1535-1545.

[9]李菲菲,范凯,张艳丽,等.Cystatin F在中枢神经系统脱髓鞘动物模型中的表达[J].神经解剖学杂志,2009,25(2)：159-162.

Establishm ent of experimentalautoimmune encephalomyelitismodel and the expression of cystatin F

GAOWen-ting1,FAN Kai2,LINing2,MA Jian-mei2
(1.Experimental Animal Center,2.Department of Anatomy,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

[Objective]To study the expression of cystatin F,which is cathepsin protease inhibitor,in experimental autoimmune encephalomyelitismodel induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55.[Methods]Myelin oligodendrocyte glycop rotein 35-55 was used to estab lish experimental autoimmune encephalomyelitismodel in C57BL/6mice,then clinical score was estimated by behaviou observation.Immunohistochemistrymethod was used to understand demylinating conditon in modelmice,and in situ hybridyzationmethod was performed to know the activity ofm icroglia cells and the expression of cystatin F.[Results]Experimentalautoimmune encephalomyelitismodel induced bymyelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 was successful.Accumu lated activatedm icroglia cellswere found around the demyelinating plaque,atmeantime cystatin F expression were also found.[Conclusion]The exp ression of cystatin F in dem yelinating disease was correlated with activated microglia cells.

experimental autoimmune encephalomyelitis;demyelination;cystatin F;microglia cells

R 512.3

A

1671-7295(2011)01-0006-05

国家自然科学基金项目(30771055);大连市优秀青年科技人才基金项目(2008J23JH 035)

2010-11-03;

2010-12-22

高文婷(1973-),女,辽宁大连人,实验师。E-mail：gwtpkwy@yahoo.cn

马坚妹,教授。E-mail：ma_jianmei@hotmail.com