大承气汤对重症胰腺炎 SIRS大鼠腹腔巨噬细胞sCD14作用的实验研究
2011-02-09郭权,毕伟
郭 权 ,毕 伟
(1.大连医科大学 附属第一医院急诊科,辽宁大连 116011;2.大连医科大学附属第一医院 普外科,辽宁大连 116011)
大承气汤对重症胰腺炎 SIRS大鼠腹腔巨噬细胞sCD14作用的实验研究
郭 权1,毕 伟2
(1.大连医科大学 附属第一医院急诊科,辽宁大连 116011;2.大连医科大学附属第一医院 普外科,辽宁大连 116011)
[目的]研究大承气汤对重症胰腺炎SIRS大鼠腹腔巨噬细胞sCD 14的作用机制。[方法]建立重症急性胰腺炎(SAP)全身炎症反应综合征(SIRS)大鼠模型。分为 5个实验组:正常组、SIRS模型组、中药组、西药组、中西结合组。用酶联免疫分析(ELISA)技术检测不同处理组中 sCD14的浓度。[结果]检测SAP大鼠腹腔 MΦsCD 14的浓度发现:中西医结合治疗组明显低于SIRS组(31.83±29.51)vs(272.82±40.68),P<0.05;中西医结合治疗组低于中药组和西药组,分别为(31.83±29.51)vs(88.97±54.8),P<0.05和(31.83±29.51)vs(83.45±35.21),P<0.05;中西医结合治疗组与正常组比较差异无显著性意义(31.83±29.51)vs(31.30±24.30),P>0.05。[结论]大承气汤治疗重症急性胰腺炎/全身炎症反应综合征时对腹腔MΦsCD 14有明显的抑制作用。
大承气汤;重症急性胰腺炎;SIRS;巨噬细胞;sCD 14
全身炎症反应综合征(SIRS)是多器官功能不全综合征(MODS)和多器官衰竭(MSOF)的前期表现。阻断 SIRS向 MODS的进展是降低诸如重症状急性胰腺炎等危重病死亡率的关键,所以 SIRS的早期诊断和治疗就显得尤为重要。SIRS的发生与几组细胞的激活和多种炎性介质的失控释放有关:这些细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等;炎性介质包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)、血小板激活因子 (PAF)、氧自由基(OFR)等。在正常情况下,中性粒细胞(PMN)以凋亡的形式被巨噬细胞[1](MΦ)识别、吞噬而清除,限制组织损伤、抑制高炎反应、促进炎症吸收。如果在感染或创伤等应激状态下 PTN凋亡延迟、释放的胞内有毒物质将加重局部炎症反应从而加重 SIRS。近年来研究表明,大承气汤能有效的防止肠道细菌移位,对内毒素性重症状急性胰腺炎 SAP/SIRS患者的病情有所改善。本实验通过制备大鼠重症急性胰腺炎全身炎症状反应综合征模型,研究大承气汤对重症急性胰腺炎 SIRS大鼠腹腔 MΦsCD14的作用。阐明腹腔 MΦ在急性胰腺炎 SIRS中的变化及可能机制,为临床药物治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 实验对象及分组:健康雄性(SD)大鼠,体重220~250g,由大连医科大学实验动物中心提供。随机分为 5组:正常组、模型组、中药组、西药组、中西结合组,每组 15只。
1.1.2 主要设备与仪器:台式高速低温离心机;PH240A型培养箱;HWS-20恒温水浴箱;流式细胞仪;酶标仪。
1.1.3 主要试剂盒及药品:可溶性 CD14(sCD14)酶联免疫分析试剂盒;地塞米松磷酸钠注射液;PBS;小牛血清;大承气汤由大连医科大学附属第一医院中药制剂科制成。
1.2 方 法
1.2.1 SAP/SIRS的 SD大鼠模型制备:模型组制备:用无菌 10%水合氯醛腹腔麻醉,腹壁正中线切口显露十二指肠,在十二指肠乳头对侧肠壁插入 1 mL小注射器针头入胆胰管,同时在胆管出肝门处用无损伤小动脉夹夹闭,逆行缓慢注入 1.5%去氧胆酸钠,观察胰腺有充血改变后,退出针头,去掉动脉夹,十二指肠复位,缝合关腹。正常组(假手术组)仅开腹后翻动胰腺数次,关腹。药物治疗:中药大承气汤经口注入;地塞米松经腹腔内注射,各治疗组于造模后立即给药 1次(术后 2 h)和造模后 12 h再次给药。正常组(假手术组)经口注入生理盐水。
1.2.2 腹腔巨噬细胞(PMΦ)的分离方法:SD大鼠术后 24 h,各组 SD大鼠麻醉奏效后,取腹壁正中线处注入 3~4 m L冰中预冷的无菌 PBS-H,轻按腹部 5min;剪开腹壁,注射器吸出腹腔液,再用等量的预冷 PBS-H冲洗腹腔 2~3次,合并渗出液于离心管中离心,1000 r/min(R=10 cm),离心 10 min,取上清;将各组收集的上清注入 EP管中,做好标记后放入 -80℃冰箱中待测。
1.2.3 胰腺组织病理形态学观察:切取部分胰腺组织,切片,常规 HE染色进行病理组织学观察,按照Kaiser[2]胰腺组织病理学评分标准进行评分。评分标准见表 1。
表 1 胰腺组织病理学评分Tab 1 The pathology score of pancreatic tissue
1.2.4 各组腹腔巨噬细胞 sCD14的检测:应用大鼠可溶性 CD14酶联免疫分析(ELISA)试剂盒。具体步骤:设空白孔、标准孔、待测样品孔。用酶标仪在 450 nm波长依序测量各孔的光密度(A值)。计算:以标准物的浓度为横坐标,A值为纵坐标,绘出标准曲线,查出相应浓度,再乘以稀释倍数;计算出标准曲线的回归方程式,将样品的 A值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
1.3 统计学方法
所有数据以 SPSS11.5统计软件处理,采用 t检验及单因素方差分析法,检测数据以均数士标准差(±s)表示。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 动物的一般情况
所有造模 SD大鼠在注射 1.5%去氧胆酸钠溶液后均逐渐出现蜷缩、悚毛、精神萎靡、反应迟钝等表现,呼吸急促、浅快,并随时间的延长而逐渐加重,后期皮肤黏膜发绀,大鼠呈现昏迷状态,严重者死亡。
2.2 大体解剖观察
在胆胰管逆行注射 1.5%去氧胆酸钠溶液后,SD大鼠的胰腺立即出现明显的局限或弥漫性充血水肿,包膜张力增加。存活大鼠开腹后可见胰腺出血坏死,腹腔内有大量血性腹水。在大网膜及胆总管处发现浅黄色的皂化斑;SD大鼠的肺也出现充血、水肿、出血;胃肠明显水肿,出现麻痹性扩张;肝脏稍微肿大,有出血点;双肾明显增大,颜色也由浅红色变成暗红色。而假手术组仅见胃肠黏膜轻度水肿,颜色略带暗红,腹腔内见少量渗出,肝、肾、胰腺未见明显改变。
2.3 光镜下胰腺组织病理学改变
假手术组胰腺小叶结构清晰。SAP/SIRS模型组胰腺实质大片坏死,出血及脂肪变性,大量红细胞淤积,血管扩张,见大量中性粒细胞浸润于组织间隙及实质内。见表 2。
表 2 各组SD大鼠胰腺组织光镜下病理评分Tab 2 The pathological scoring of pancreatic tissue under lightmicroscope in SD rats of each group
2.4 各组巨噬细胞 sCD14吸光度(A值)、浓度分析
经分析可以明确各组巨噬细胞 sCD14吸光度(A值)及浓度的变化,中西结合组与正常组比较差异无显著性意义;中西结合组与模型组、中药组、西药组比较差异均有显著性意义;特别是中西结合组与模型组比较,sCD14浓度明显下降。见表 3。
表 3 各组巨噬细胞 sCD 14吸光度(A值)、浓度统计分析Tab 3The statistical analysis of optical density(A value)and concentration of sCD14ofmacrophage in SD rats of each group
3 讨 论
全身炎症反应综合征(SIRS)可由菌血症、真菌血症等及严重创伤、重症急性胰腺炎等感染或非感染因素引起。通过激活炎症细胞引起机体持续过度的炎症反应,致使细胞因子、自由基、补体系统和其他多种炎性介质的大量释放,最终导致 SIRS的发生[3]。巨噬细胞(MΦ)具有消化和杀伤侵入微生物的能力,激活的 MΦ能释放可溶性物质和氧化代谢产物,是机体防御和炎症反应中细胞因子的最大来源。MΦ能够吞噬细胞碎片、衰老或凋亡细胞、尘粒、病原菌等,具有较强的吞噬能力。研究表明,MΦ吞噬凋亡中性粒细胞后,通过产生抗炎症细胞因子 TGF-β1来抑制炎症因子 IL-1B、TNF-a等的产生,并抑制 MΦ递呈凋亡细胞相关抗原[4],此时并不造成凋亡细胞的溶酶体、线粒体及细胞膜破裂,不引起炎症反应和周围组织损伤,故 MΦ的吞噬功能在炎症转归方面有着重要意义。如果 MΦ识别、吞噬凋亡细胞的机制受损,凋亡细胞不能被及时吞噬,即会肿胀、裂解、释放毒性内容物,引起周围组织和细胞的进一步损害。重症急性胰腺炎 SIRS时腹水使腹腔 MΦ对凋亡细胞的清除能力下降[5],从而引起失控的 SIRS和 MODS。
CD14是 SIRS时细菌产生内毒素(LPS)的特异性受体,受 LPS对其分泌表达的调节,接受 LPS信号激活的单核巨噬细胞 CD14的合成表达增加。CD14主要分布于单核巨噬细胞表面,以腹腔 MΦ表达较强。CD14以膜性 CD14(mCD 14)和可溶性CD14(sCD 14)两种形式存在,mCD14排泄或入血形成 sCD14,mCD14是 MΦ识别和吞噬凋亡细胞的主要受体之一。sCD14参与 LPS等多种病原体成分与细胞间反应,在其中表现出抑制和活化双重作用,调节免疫反应。在生理状态下 sCD14还参与调节细胞免疫和体液免疫以及脂类转运。当单核巨噬细胞接受 LPS炎症信号刺激时,通过 mCD14信号传导通路分泌多种细胞因子。而对于一些无 mCD14的炎性细胞对 LPS的刺激反应则主要由 sCD14来介导,sCD14与 LPS或革兰阴性菌的结合又可降低LPS对单核细胞的过度刺激,使单核巨噬细胞的细胞反应减弱,防止了一些炎性损伤因子的过度翻译,形成利于机体的免疫调节机制。在急性胰腺炎SIRS早期,可能是受到肠道革兰阴性菌及其内毒素影响所致[6],mCD14和 sCD14呈同步升高,可能是机体自身调节的结果;sCD14升高可能的作用:机体要清除外来的抗原性物质,同时又要防止自身细胞的损伤。高浓度的 sCD14竞争性地抑制 LPS与mCD14的结合,抑制 LPS对单核巨噬细胞和中性粒细胞的激活作用。提示单核巨噬细胞在炎症反应中存在着损伤和抗损伤的作用,体现了单核巨噬细胞功能的完整性。
大承气汤有效成分是大黄、厚朴、枳实与芒硝。其中大黄具有抑酶、抑菌、导泻、解除胆道 oddi括约肌痉挛功效,而且具有活血化癖、改善微循环、清除胃肠道内细菌和毒素[7],改善胃肠黏膜血流灌注的作用。大黄还能降低严重创伤、休克、感染等患者应激性肠黏膜病变、多器官功能失调综合征的发生率,能明显降低多器官功能失调综合征患者血浆肿瘤坏死因子 -α、内毒素含量,能提高重症急性胰腺炎治愈率。中药厚朴中含有生物活性物质厚朴酚,有治疗实热内阻、腑气不行,下气除满之功效;芒硝咸寒润降、泻热通便,促黄疸消退。枳实有行气消痞之功效。本实验结果表明,大承气汤可明显改善大鼠重症急性胰腺炎的机体内环境,大鼠腹腔 MΦsCD 14水平在 SIRS组升高,应用中药大承气汤组较模型组明显下降(P<0.05),提示大承气汤能有效减缓胰腺炎的进展。目前,大承气汤已经广泛用于如重症急性胰腺炎等危重病的治疗,随着对其药理作用的深入研究,大承气汤有望成为临床上治疗重症急性胰腺炎的常规用药。
糖皮质激素通过受体的介导,作用炎症的起始环节,具有抑制炎性渗出、白细胞浸润和炎症介质的生成和释放作用,是很强的抗炎激素,能降低重症胰腺炎时胰腺的坏死程度。本实验研究发现,地塞米松能显著改善胰腺的病理状态,同时能维持内环境稳态。地塞米松治疗组腹腔 MΦsCD14蛋白的表达水平明显低于 SAP/SIRS模型组(P<0.05)。在体内和体外实验中发现急性炎症患者接受糖皮质激素治疗时,血清 sCD14的浓度和外周血单核细胞mCD14R的表达都被显著抑制。有研究发现,在体外低剂量地塞米松对小鼠MΦ的吞噬功能有明显的抑制作用[8]。这些与本实验地塞米松在体外的作用一致。
重症急性胰腺炎 SIRS时腹腔 MΦSCD14水平明显升高,可能与内毒素脂蛋白(LPS)调节相关;大承气汤联合地塞米松用药使 SAP/SIRS大鼠腹腔MΦSCD14浓度下调作用最为显著。
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Study of function sCD 14 of Da Cheng Qi Tang SIRS in severe acute pancreatitis in rat peritonealmacrophages
GUO Quan1,BIWei2
(1.Department of Emergency,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China;2.Departmentof Surgery,the First Affiliated Hospitalof Dalian Medical University,Dalian 116011,China)
[Objective]To study the function of app lied Da Cheng Qi Tang to SIRS in severe acute pancreatitis in SAP/SIRS rat peritonealmacrophage sCD 14.[Methods]Severe acute pancreatitis SIRS ratmodel was set up.Five groups included control,SIRS,traditionalmedicine,westernmedicine,integrated traditional and westernmedicine groups.Concentration of sCD14was detected by ELISA in all of the groups.[Results]PMΦs in integrated traditional and western medicine groups wereobviously lower than that in SIRS group(31.83±29.51)vs(272.82±40.68),P<0.05,and it in integrated traditionaland westernmedicine group was obviously lower than that in traditionalmedicineand westernmedicine groups respectively(31.83±29.51)vs(88.97±54.80),P<0.05;(31.83±29.51)vs(83.45±35.21),P<0.05.There was no difference between integrated traditional and westernmedicine group and control group(31.83±29.51)vs(31.30±24.30),P>0.05.[Conclusion]Da Cheng Qi Tang treatmenthas inhibiting effect on PMΦsCD 14 in SAP/SIRS.
Da Cheng Qi Tang;severe acute pancreatitis;SIRS;macrophage;sCD 14
R 576
A
1671-7295(2011)01-0036-04
2010-10-11;
2010-11-22
郭 权(1970-),男,辽宁锦州人,副教授,硕士。E-mail:xiangermuyou@sina.com