改良Hale胶体铁组合染色用于杯状细胞染色效果

丁桂龄，郑建明，刘艳芳，蒋 慧

肠道是人体内极为重要的器官，不仅具有消化吸收营养物质和产生多种激素的作用，还具有重要的免疫屏障功能。肠道黏膜表面覆盖着一层保护性黏液凝胶，该凝胶及其周边的多种细胞通过病理生理机制共同参与维持肠道稳态。杯状细胞是肠道黏膜免疫屏障功能中产生免疫应答反应的重要细胞，其分化和分泌功能的改变可导致黏液凝胶成分的改变，在肠道疾病的发生、发展过程中扮演着重要角色。作者经过实践，采用改良Hale胶体铁组合染色法，可较好地显示肠道组织中的杯状细胞，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取海军军医大学附属长海医院病理科存档的十二指肠和结肠手术切除标本合计10例，所有标本均经10%中性福尔马林固定后取材，行常规流程制成3 μm厚石蜡切片，75 ℃烤台烤片20 min。

1.2 试剂及配制(1)胶体铁原液：30%氯化铁5 mL，蒸馏水250 mL。先将盛有250 mL蒸馏水的加盖烧杯置于电磁炉上加热使液体沸腾，然后向烧杯内滴加30%氯化铁5 mL，待溶液变成砖红色后停止加热，最后将烧杯转移至磁力搅拌器上，直至溶液变成混匀且均一的砖红色，待液体冷却后，将其存放于棕色试剂瓶中于室温下保存。(2)胶体铁染液：胶体铁原液20 mL，乙酸5 mL，蒸馏水15 mL。为显示实验效果，本实验采取染液临用前新配制，其pH值调整为1.4。(3)乙酸液：乙酸3 mL，蒸馏水100 mL。(4)亚铁氰化钾盐酸液：5%亚铁氰化钾水溶液15 mL，5%盐酸15 mL，临用前新配制。(5)丽春红苦味酸染色液：0.5%丽春红S水溶液10 mL，苦味酸饱和水溶液90 mL。

1.3 方法组织切片经脱蜡至水，入乙酸液浸洗2 min。先直接浸入盛有胶体铁染液的立式染色缸中40 min，再浸入乙酸液浸洗3 min，而后浸入盛有亚铁氰化钾盐酸液的立式染色缸中10 min。自来水洗2 min，0.5%丽春红苦味酸S水溶液滴染3 min，无水乙醇脱水，冷风干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结果

染色后肠道黏膜中分布数量不等的杯状细胞，呈蓝色或深蓝色；顶部胞质内的黏蛋白呈淡蓝色或深蓝色；胶原纤维呈粉红色；染色鲜明，镜下易辨认，背景色理想(图1～3)。

图1 乙状结肠杯状细胞(红箭头)呈蓝色或深蓝色，胶原纤维(黑箭头)呈红褐色，改良Hale胶体铁组合染色 图2 乙状结肠杯状细胞(红箭头)呈蓝色或深蓝色，改良Hale胶体铁组合染色 图3 十二指肠杯状细胞(红箭头)呈蓝色或深蓝色，顶部胞质内的黏蛋白呈淡蓝色(黄箭头)，吸收细胞(紫箭头)呈亮白色，改良Hale胶体铁组合染色

3 讨论

杯状细胞分泌的黏蛋白可与水、无机盐等结合形成附着在肠黏膜表面的黏液层，黏液层与肠上皮细胞、肠道微生态和宿主的免疫系统相互作用，共同维持肠道内环境的稳态[1]，并参与多种肠道疾病的发生、发展。临床病理工作中多数工作者首选杯状细胞的染色方法多为PAS染色或阿尔辛蓝染色。对于PAS染色，作者实际操作中发现该染色法着染的成分较多，不仅对于基膜、真菌、糖原、十二指肠腺等均能着色，还会在操作欠妥下造成组织整体一片红染，该染色法的特异性和对比度有待再实践。对于阿尔辛蓝染色，虽实际操作简单且也可显示杯状细胞，但作者及部分同行在实际操作中发现，其对杯状细胞的着色较淡，这不排除不同单位采购试剂质量和浓度的差异。改良Hale胶体铁组合染色能较好地显示杯状细胞，这可能与杯状细胞自身结构及其分泌物的成分有关。杯状细胞是一种典型的黏液细胞，其主要成分黏蛋白在酸性条件下能吸附胶体铁染液中的Fe3+而形成稳定的聚合物，再与亚铁氰化钾盐酸结合而牢固着色[2]。改良法有以下特色：(1)胶体铁原液配置的过程，更改了不仅费时费力、还有液体飞溅可能的手动摇晃方式，借助磁力搅拌器，即节省了人力、又保证了实验安全、还能较好地混匀液体。(2)将原始方法中3%亚铁氰化钾和3%盐酸的浓度均提高到5%，可以更快地激活杯状细胞分泌的黏蛋白物质，促进染色反应的进行，染色后的杯状细胞清晰可见。这可能是因为杯状细胞的分泌物黏蛋白包含的酸性黏多糖物质作为反应基础，在适当的酸性条件下能吸附胶体铁染液中的Fe3+而形成稳定的、有较高电子密度的聚合物[3]，再与5%亚铁氰化钾盐酸作用，杯状细胞内的酸性黏多糖物质被牢固结合，从而能对杯状细胞较好地着色。(3)组合染色选用0.5%丽春红苦味酸S水溶液，既可以区分胶原纤维和肌纤维、增强整体染色的色泽度，又可以较好地观察杯状细胞与其毗邻组织的形态关系，还可以辅助临床病理中有关肠壁纤维化等疾病的诊断。染色过程中：切片需处于酸性条件下，乙酸液浸洗必须充分；为保证有足够的染色液反应和切片着色均匀，胶体铁染液和亚铁氰化钾盐酸液必须现用现配，该步骤的染色反应建议在干净的立式染色缸中进行。

综上所述，改良Hale胶体铁组合染色法对于杯状细胞的显示，特异性强，敏感性高，定位准确，结果易于判读。