大鼠结膜杯状细胞的体外培养及鉴定

何 敏 赵长青 武耀红 秦维山 杜玲珍

(山西医科大学第二医院眼科，山西 太原 030001)

大鼠结膜杯状细胞的体外培养及鉴定

何 敏 赵长青1武耀红 秦维山 杜玲珍

(山西医科大学第二医院眼科，山西 太原 030001)

目的 体外分离、培养大鼠结膜杯状细胞，观察其形态、结构等生物学特征。方法 取大鼠穹隆部结膜，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中行组织块培养，5～7 d后酶消化法传代。观察原代及传代细胞的形态及生长情况，并应用特殊免疫组化染色方法分别对原代、传代培养的杯状细胞进行鉴定，用ImageJ软件计算细胞纯度。结果 倒置相差显微镜下可见杯状细胞呈鹅卵石样，5～7 d在组织块周围形成环状结节。免疫组化结果显示，培养的原代细胞角蛋白(CK)4染色阴性，CK7染色阳性，且CK7阳性细胞数占(97.3±2.0)%。传代杯状细胞中，绝大多数凝集素UEA-I染色为阳性，阳性细胞占(91.2±2.7)%。结论 大鼠穹窿部结膜可以成功培养出杯状细胞，传代细胞仍保持原代细胞特性，且纯度较高。

结膜杯状细胞；细胞培养

结膜上皮是构成眼表的重要结构，它不仅是眼表抵御外界环境干扰的一道屏障，而且对于维持眼表的健康、维持视觉质量都起到重要作用。结膜上皮由复层鳞状上皮细胞和杯状细胞组成，它们除了可以分泌水和电解质，还分泌黏蛋白。其中杯状细胞分泌的大分子糖蛋白是泪膜的主要成分，也是构成泪液中可溶性黏液的主要部分，对于维持眼表的健康意义重大。越来越多的实验证明，杯状细胞不仅参与分泌黏蛋白，而且黏蛋白的分泌受到组胺、白介素、上皮生长因子等调节〔1～3〕，它已被认为是一种免疫细胞，参与了眼表的免疫反应〔4〕。因此对于杯状细胞的研究已经成为近年来研究的热点。

对于结膜杯状细胞体外培养的研究国外学者已有较多报道〔5～7〕，但国内只有较少的学者对人和兔的结膜杯状细胞进行了研究〔8，9〕。因为人的正常结膜组织来源有限，因此本实验通过对大鼠的结膜杯状细胞进行分离、培养、传代及鉴定，为进一步深入研究杯状细胞的病理生理特性提供可靠的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，出生后4～6 w，体重125～150 g，山西医科大学实验动物中心提供。实验动物及所有实验得到了山西医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂 RPMI1640培养基来源于美国BioWhittaker公司，抗细胞角蛋白(CK)7鼠抗体来源于美国Santa Cruz生物技术公司，抗细胞CK4兔抗体来源于美国Abcam生物技术公司，交联FITC的凝集素UEA-I来源于美国Pierce公司，胎牛血清来源于美国Hyclone公司。Cy3抗鼠IgG，Cy2抗兔IgG来源于美国Jackson ImmunoResearch公司。

1.3 方法

1.3.1 结膜杯状细胞的分离、培养及传代 大鼠于CO2室箱内约1～2 min后致死，断头，从双眼取穹窿部结膜。将取下的组织放于盛有完全RPMI 1 640 培养基(包含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 μg/ml青链霉素，10 mmol/L Hepes缓冲液，1 mmol/L丙酮酸钠，1%100×非必需氨基酸混合物)的塑料器皿中，于显微镜下将结膜下脂肪及筋膜组织剔除，并将其切割成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，更换培养液后备用。取六孔板，每孔加0.5 ml的完全RPMI 1 640培养基。将分割好的结膜组织块分散放于培养皿底部，每孔约8～10块组织，然后放于37℃含95% O2、5% CO2的孵箱内。48 h后，小心补充0.5 ml的培养基，防止组织块松动、漂浮。3 d后全量换液。

1.3.2 结膜杯状细胞的传代 5～7 d后，取出培养皿，在显微镜下用标记笔标出组织块周围的杯状细胞，并用刮板将成纤维细胞刮除。吸出培养皿底部的组织块及培养液，用PBS液清洗3次，每次约加入1 ml。然后室温下加入1 ml Versene液8～10 min，以分散细胞。吸出Versene，每孔加入0.25 mol/L的胰蛋白酶1～1.5 ml，在37℃孵育箱内放置约10 min。然后每孔加入完全培养液 1.5 ml，终止消化。用吸管反复轻柔吹打1～2 min。将混合液吸入50 ml离心管，用离心机1 000 r/min，离心10 min，吸除上清液，加入完全RPMI 1640培养液，反复吹打5 min，重悬细胞，然后接种于24孔或6孔板，每孔约0.5 ml或者1.0 ml，接种密度为每孔(5～10)×104。初始换液24～48 h，以后2～3 d换液一次。待细胞铺满80%后使用。

1.3.3 大鼠结膜杯状细胞的鉴定

1.3.3.1 形态学检查 在光学显微镜下观察原代及传代杯状细胞的形态、大小、生长情况并进行拍照。

1.3.3.2 原代杯状细胞鉴定及纯度分析 将大鼠结膜上皮组织块直接种植在盛有载玻片的培养皿上原代培养，7 d后吸出培养液，用1×PBS液清洗1次，加入1 ml甲醇固定15～30 min，然后吸出甲醇，用1×PBS液漂洗3次。再加入2 ml 1×PBS液放于4℃冰箱保存待用。将固定好的载玻片取出，放于固定架上，浸于盛有1×PBS液的烧杯中，于摇床上清洗5 min。将载玻片放入 2%BSA 封闭液中，在摇床上轻摇30 min～2 h。 取出载玻片，将1∶100的含CK7 抗体和CK4抗体的0.2% BSA稀释液浸满载玻片表面，放置于湿盒内于4℃冰箱孵育过夜。1∶100的含正常鼠的IgG抗体作为阴性对照组。取出载玻片，在摇床上用1×PBS液漂洗3次，每次10 min。制备新的BSA稀释液，室温下加入1∶300的Cy3和Cy2混合液孵育1 h(避光)。再用1×PBS液漂洗3次，用含有DAPI的封片剂封片。在暗箱内风干过夜，次日在荧光显微镜下观察。选取组织块和环状细胞结节外围之间3、6、9、12点钟的等距位置，用ImageJ 1.48v软件计算DAPI核染色阳性的总细胞数及CK7 和CK4 阳性细胞，并计算各自百分比。

1.3.3.3 传代杯状细胞的鉴定及纯度分析 将消化后的细胞接种在盛有载玻片的培养皿上，然后固定(方法同上)。将1∶100的含CK7 抗体的稀释液浸满载玻片表面，1∶100的含正常鼠的IgG抗体作为阴性对照组，放置于湿盒内于4℃冰箱孵育过夜。在1 ml稀释液中加入2 μl UEA-I(与FITC荧光素共轭)抗体。600 μl上述UEA-I溶液加入2 μl Cy3(2抗)制备成Cy3混合液。孵育1 h(避光)。封片后荧光显微镜下观察。随机选取4个镜下视野，用ImageJ 1.48v软件计算DAPI核染色阳性的总细胞数、UEA-I 阳性细胞及CK7阳性细胞，并计算各自所占百分比。

2 结 果

2.1 杯状细胞分离、生长及形态 在细胞培养的24 h内，组织块周边可见有贴附的细胞。36～48 h后，鹅卵石样的杯状细胞清晰可见。在原代培养的5～7 d，杯状细胞围绕在组织块周围形成环形结节(图1)。但并不是每一个组织块都形成环形结节，在5 d左右的时间将未生长出细胞的结节去除，此外有些组织块在生长至3～5 d时在环形结节的外围可见有梭形的成纤维细胞。为了使细胞得以纯化，这些成纤维细胞在传代时需要被仔细刮除。杯状细胞呈鹅卵石样，大小相近，在显微镜下可见其表面有小滴，这是其分泌的黏蛋白。随着杯状细胞的增生，蛋白小滴也增多。当细胞增生到一定程度后，即原代培养5～7 d后，用酶消化法传代，传代的细胞在形态上与原代相似。

图1 大鼠穹隆结膜组织块在含10%胎牛血清的RMPI 1640培养液中培养7 d后形成的环状结节(×40)

2.2 原代杯状细胞CK7和CK4鉴定及纯度分析 培养的原代细胞CK4阴性、CK7染色阳性，证明培养的细胞为杯状细胞(图2)。对3个不同来源的结膜组织的标本进行染色计算，CK7阳性细胞占(97.3±2.0)%，CK4阳性细胞占(0.1±0.1)%。在正常老鼠IgG 阴性对照组中未见荧光染色阳性。

2.3 传代细胞UEA-I和CK7鉴定及纯度分析 对3个不同来源的结膜组织的标本进行染色计算，传代培养的一代杯状细胞中UEA-I染色阳性细胞占(91.2±2.7)%，CK7染色阳性细胞占(92.4±3.2)%，进一步证明传代后的杯状细胞仍保留有原来的功能和特性，且具有较高纯度。见图3。

A.培养的细胞核被DAPI染为蓝色;B.CK4 染色，阳性细胞胞浆中间丝染为绿色，但培养的细胞染色为阴性;C.CK7 染色，阳性细胞胞浆中间丝染为红色;D.ABC融合后的图像图2 原代培养结膜杯状细胞的鉴定(×200)

图3 一代结膜杯状细胞的鉴定(×400)

3 讨 论

随着环境及生活方式的改变，干眼、过敏性结膜炎等眼表疾病也越来越受到人们关注。其中，杯状细胞在维持眼表的完整性及在眼表疾病免疫调节中的作用也开始被人们认识。为了进一步研究杯状细胞的结构、功能以及它对于环境、物理、化学等因素影响的变化，需要我们建立一个优质的体外细胞模型。本实验研究取材于大鼠的上下穹窿部结膜，相对于球结膜和睑结膜，穹窿部结膜的杯状细胞增生能力更高〔10〕。使用加入L-谷氨酰胺、抗生素、小牛血清的RPMI 1640培养基后，大鼠结膜的杯状细胞可以在24 h内就从穹窿结膜组织中分离出来，并增生形成环状结节。因为杯状细胞分泌黏蛋白，使得杯状细胞与培养皿黏附紧密，因此在传代时需要加入乙二胺四乙酸(Versense)，使得贴服的细胞更容易离散。培养5～7 d时有些组织块的环形细胞结节周边可见有梭形的成纤维细胞增生，因此在传代过程中，要仔细刮除这些成纤维细胞，使细胞得以纯化，实验证明传代后的细胞仍然完整保留有杯状细胞标记和功能活动，且纯度较高。

CK是一种中间丝，它是一类存在于上皮细胞中的结构蛋白，具有极高的保守性和组织分化特异性，与上皮细胞的增殖分化密切相关。其中CK7是分泌性上皮细胞的标志物，不仅是一些上皮恶性肿瘤细胞的标记物，而且在正常组织中也是杯状细胞的特异标志〔11〕。CK4是复层鳞状上皮细胞的标志物，见于舌、会厌及食道上皮组织，在结膜组织中，它是非杯状细胞的复层鳞状上皮细胞的特异标志〔12〕。本实验通过免疫组化染色，证明所培养细胞是结膜杯状细胞。

凝集素UEA-I是一种高分子量的糖复合物，它是杯状细胞分泌产物中糖蛋白上的L-岩藻糖，存在于细胞体内，染色阳性表现为绕核分布的胞质着色，呈囊泡状〔13〕。我们发现，传代的杯状细胞的UEA-I及CK7阳性率均在90%以上，且形态和原代相似，进一步表明经过酶消化法传代的杯状细胞仍具有原代杯状细胞的形态和特性，一般传3～5代杯状细胞形态及功能未发生改变，一代的杯状细胞性状更稳定，常用于体外实验研究〔5〕，可以作为细胞模型用于进行体外生物学研究。

本研究表明，选取大鼠的穹窿部结膜，可以分离和培养出结膜杯状细胞，且消化传代后的细胞仍然完整保留有杯状细胞的标记和功能，且纯度较高，可以为今后进一步研究杯状细胞相关的眼表疾病提供有效的细胞模型。

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8 杜园园，苏冠方，刘早霞,等.兔结膜杯状细胞的无血清培养法〔J〕.中国实验诊断学，2007；11：1096-7.

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〔2016-07-15修回〕

(编辑 徐 杰)

山西省回国留学人员科研资助项目(2016-062)

1 山西医科大学第二医院耳鼻喉科

赵长青(1961-)，男，教授，主任医师，博士，主要从事变应性鼻炎的发病机制研究。

何 敏(1975-)，女，硕士，讲师，主要从事眼表疾病及眼免疫研究。

R33

A

1005-9202(2017)07-1585-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.009