胸膜肺炎放线杆菌血清1型与5型基因组DNA差异基因的筛选与鉴定

谢 芳，韩文瑜，杜崇涛，周 靓，杨舒心，雷连成*

(1.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起，以胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎为特征，一种高度传染性、致死性呼吸系统疾病[1]，呈世界性分布，给养猪业造成重大经济损失。根据荚膜多糖和脂多糖抗原性的不同将APP分为15个血清型[2]，其中血清型1、5、9和11毒力最强，其他血清型如3型和6型的毒力较低[3]。APP各血清型间的致病性和免疫原性有明显差异，没有或仅有较弱的交叉反应，导致不同血清型间缺乏交叉保护力[4]。由于APP致病机理尚不明确，全基因组序列未完全测定，APP各血清型间的差异基因鲜有报道，因此，无法确认导致APP各血清型间感染和致病性差异的原因，使该菌引起的PCP的防制十分困难。

代表性差异分析(Representational difference analysis，RDA)是一种鉴定、分离差异基因的技术。该技术将差减杂交方法与PCR技术相结合，应用识别4个碱基的内切酶充分消化测试组(Tester)和驱动组(Driver)的DNA，PCR富集两组DNA片段，经过3次差减杂交，去除共有基因，利用PCR技术富集测试组中特异基因的DNA片段。该技术与其他消减杂交技术相比，是一种相对高效、敏感和特异的差异基因筛选方法，应用广泛[5]。本研究以APP血清1型和5型为研究对象，利用RDA技术，分别筛选APP血清1型和5型的差减基因，为APP不同血清型间基因差异的研究奠定基础，同时，也为APP感染致病机理的研究及新型疫苗的开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 细菌株 APP血清1型(APP1)CVCC259株和APP血清5型(APP5)CVCC263株均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

1.2 主要试剂 QIAquick PCR purification Kit购自QIAGEN公司；DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit购自Roche公司；Sau3AⅠ限制性内切酶、T4连接酶、ExTaq酶、dNTP和豆芽核酸酶均购自TaKaRa公司。

1.3 APP1和APP5全基因组的提取 将APP1和APP5分别接种于脑、心浸萃液肉汤琼脂(BHI)液体培养基内，37℃过夜培养，按照文献[6]的方法分别提取DNA。

1.4 RDA富集差异片段 按照文献[7]方法对差异片段进行富集，引物由TaKaRa公司合成(表1)。分别取APP1和APP5的基因组DNA，用Sau3AⅠ酶切，经酚和氯仿抽提后，与接头R-Bgl 24/12连接，经PCR扩增，制备代表性测试组扩增子和驱动组扩增子。将测试组扩增子和驱动组扩增子按体积比1∶100混合，用 PCR扩增富集第一轮差异片段(DP1)。将DP1与驱动组扩增子按体积比 1∶400混合，进行第二轮差减杂交。取第二轮差异片段(DP2)和驱动组扩增子混合，经PCR扩增，得到第三轮差异片段(DP3)。以APP1 CVCC259株作为测试组，APP5 CVCC263株作为驱动组获得的差异片段称为“c”；以 APP5 CVCC263株作为测试组，APP1 CVCC259株作为驱动组获得的差异片段称为“d”。

表1 RDA试验用引物序列Table 1 The primers and sequences for RDA test

1.5 差异片段测序与分析 DP3的PCR产物经QIAquick PCR purification Kit纯化，与pMD18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，筛选阳性克隆菌，由北京六合华大基因科技股份有限公司测序，并在GenBank中进行BLAST比对。

1.6 Southern blot分析 按照DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ说明书进行。用Sau3AⅠ酶切基因组DNA，采用DIG-High Prime标记制备探针。将差异片段点样于尼龙膜上，并与探针于41℃杂交16 h～20 h，封闭30 min，显色并记录结果。用引物J-Bgl 24扩增差异片段，并以J-Bgl 24作为阴性对照，以试剂盒提供的DIG标记的对照DNA作为阳性对照。

2 结果

2.1 RDA富集差异片段 以APP1 CVCC259株为检测子，APP5 CVCC263株为驱动子进行差减杂交，结果显示差异片段富集增强，在250 bp～500 bp间得到差异扩增带；以APP5 CVCC263株为检测子，APP1 CVCC259株为驱动子经过3轮差减杂交，在200 bp～400 bp之间得到差异扩增带(图1)。

2.2 差异片段序列的测定与分析 将所得差异基因在GenBank中进行BLAST分析，APP1筛选出8条差异基因，并且与已测序的APP5 L20株无同源序列(表2)；从APP5筛选出12条差异基因，均与APP5 L20株(CP000569.1)存在同源序列(表 3)。

2.3 差异片段的Southern blot分析 分别将APP1的8条差异基因转化子与APP5的12条差异基因转化子进行PCR扩增，与基因组DNA探针进行Southern blot。结果显示：APP1的8条差异片段与APP1基因组DNA探针均得到阳性杂交斑，与APP5基因组DNA探针未见明显的杂交斑，表明获得的差异片段均来自APP5；APP512条差异片段与APP5型基因组DNA探针杂交均得到阳性杂交斑，与APP1基因组DNA探针杂交未见明显的杂交斑，表明获得的差异片段均来自APP5(图2)。

图1 RDA差异产物Fig.1 Genomic RDA difference products

表2 APP1 CVCC259株差异基因同源序列检索结果Table 2 The BLAST result of differential genes of APP1 CVCC259 strain

表3 APP5 CVCC263株差异基因同源序列检索结果Table 3 The BLAST results of differential genes of APP5 CVCC263 strain

3 讨论

APP共有15个血清型，但全基因组序列报道较少，不同血清型之间可能存在未被发现的差异基因，并影响其致病性和免疫原性。APP血清型的复杂性导致PCP的预防、诊断和治疗存在问题。因此，对于APP各型间差异的研究尤为重要。本研究利用RDA技术，分别构建了APP1和APP5的基因组差减文库，筛选出APP1的8个特异基因片段和APP5的12个特异基因片段。其中，部分基因已经证实为毒力基因，如APP1上获得的cps(Small coat protein)基因片段，cps是APP重要的毒力因子[7]。APP不同血清型的毒力不同，与荚膜存在一定关系。菌株产生荚膜的数量、类型以及荚膜分泌机制与APP对猪的致病性有关[8]。

血清1型和血清5型的研究发现，两型间存在不同的ABC转运(ATP-binding-cassette transporters)系统成分，这些转运子在营养的摄取、毒素及抗菌物质的分泌方面起到重要作用，是重要的毒力因子[9]。此外，APP1含有一条噬菌体的基因片段，众多研究表明细菌的毒力因子与噬菌体的转换有关。噬菌体不但是细菌毒力基因水平转移的重要载体，而且在细菌毒力表达的过程中也充当着重要的前体物质[10]。APP5中的一条glf基因片段，glf基因编码UDP半乳糖吡喃糖变位酶，呋喃半乳糖代谢的关键酶。呋喃半乳糖是细菌细胞壁的必要成分，对细菌的生长繁殖和致病性十分重要[11]。已有研究证实靶向缺失glf基因会导致毒力减弱[12]。而且，并未在哺乳动物中发现呋喃半乳糖，因此，这可能是化学治疗发展的目标[13]。另外，APP5中还有一条糖基转移酶基因片段。近年来，许多新发现的糖基转移酶的功能研究均证实其与细菌的毒力有密切关系[14-15]。在某些细菌中，糖基转移酶参与胞膜的糖脂合成、生物被膜聚集以及粘附宿主细胞，与影响毒力有关[16]。

本实验从DNA水平对APP不同血清型的差异进行研究，分别筛选出APP1相对于APP5特有的8个差异基因片段和APP5相对于APP1型特有的12个差异基因片段，为今后APP感染机制和致病力差异机制的研究奠定基础，并为APP的防制提供新的研究思路。

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