猪圆环病毒2型分离株优势基因型分析与检测

郭抗抗，张彦明，张 红，刘华科，宁蓬勃，王晶钰

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus)成员，为环状、无囊膜、单链DNA病毒[1]。按致病性可将PCV分为2个型，即无致病性的PCV1和致病性的 PCV2[2]。PCV2是猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的病原，可以引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)为代表的多种疾病，对养猪业的危害严重[3]。研究表明，根据基因组序列的差异将PCV2分为2个主要的型(群)，即PCV2A和PCV2B[4-5]。PCV2A基因组全长为1768 bp，PCV2B为1767 bp，两者主要的差异位于ORF2区域，是由1040位(存在于ORF2)核苷酸的缺失或插入造成的。PCV2B在ORF2中有一段序列1486-TCA/AAC/CCC/CG，而PCV2A中序列则为ACC/AAC/AAA/AT，这是2个基因型的最大差异区域。有研究表明PCV2A和PCV2B致病性不同，PCV2B是造成近年来猪圆环病毒病在全球许多国家，特别是在北美地区暴发流行的主要原因，Carman[6]、Gagnon[5]和 Cheung[7]等都先后在研究中发现了PCV2B分离株大量增加的现象。

我国也是受PCV2危害严重的国家之一，国内有学者对PCV2分离株的基因型进行了检测分类，认为目前国内猪群中也是以PCV2B型感染为主[8]，但在PCV2基因型的变化和当前主要流行基因型的分析方面可参考的资料有限。本研究对1999年～2009年GenBank登录的PCV2分离株的基因型变化进行了分析。同时，建立了PCV2A和PCV2B PCR检测方法，并对陕西省杨凌地区收集的部分病料的PCV2进行了检测和基因型分析。

1 材料和方法

1.1 病毒株与病料 PCV2A和PCV2B的PK-15细胞培养物，由西北农林科技大学动物医学院重大动物疾病防治与畜产品安全实验室保存；病猪组织病料(肾脏、脾脏、肺和淋巴结)采自陕西省杨凌地区3个猪场的17头患病仔猪和肥育猪；血液样品采自杨凌某屠宰场生猪，分离血清，共53份。病料均在-40℃保存备用。

1.2 主要试剂和酶 AxyPrep基因组DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；PCR试剂购自Fermentas公司；小量凝胶回收试剂盒购自北京百泰克公司；限制性内切酶XbaⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司；100 bp DNA Marker和DL2000 DNA Marker均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 引物设计 对比NCBI登录的PCV2A(36个分离株全序列)和PCV2B(75个分离株全序列)基因组的差异，筛选差异显著区段分别设计可特异性扩增PCV2A和PCV2B的引物。引物序列如下：F-PCV2A：5'-C CAGTTCGTCACCCTTTCC-3'，R-PCV2A：5'-GGGG GACCAACAAAATCTC-3'，预期扩增产物长度为548 bp；F-PCV2B：5'-GTGGTCTACATTTCCAGCAG TT-3'，R-PCV2B：5'-GCTCAAACCCCCGCTC-3'，预期扩增片段大小为332 bp。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，使用浓度为10 μmol/L。

1.4 PCV2分离株全基因序列的获得 在NCBI中检索1999年～2009年PCV2分离株全基因序列，分析不同分离期间内PCV2基因型的变化；同时，对国内2003年～2009年PCV2分离株的基因型变化进行分析。

1.5 PCR检测方法的建立 分别提取PCV2A和PCV2B感染的PK-15细胞培养物的总DNA(按试剂盒说明书进行)，以设计的特异性引物建立PCV2A和PCV2B的PCR检测方法。对引物、dNTPs、DNA聚合酶的最佳浓度，PCR反应程序及方法的重复性进行优化，并对PCR产物进行序列分析，以建立PCV2A和PCV2B的PCR检测方法。测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.6 病料样品检测 分别提取病料样品的总DNA(病料组织 15 mg/管～20 mg/管，血清 100 μL/管)，100 μL TE缓冲液溶解样品DNA；用建立的PCR方法对病料中的PCV2A和PCV2B进行检测，20 μL PCR体系中模板用量为1 μL。

2 结果与讨论

2.1 PCV2分离株基因型的变化分析

2.1.1 PCV2分离株的基因型分析 共检索到1999年～2009年PCV2分离株全序列556个。基因型分析表明，1999年～2000年的PCV2分离株均为PCV2A，2001年～2002年也以PCV2A为主，但已经有PCV2B毒株的出现；从2003年开始发现的PCV2B毒株比例超过PCV2A，并呈不断升高的趋势，其中2004年65个PCV2分离株中PCV2B为62个，占95.4%，在2007年～2009年均超过76%(表1)。虽然PCV2分离株优势基因型在不同的国家和地区存在差异，但可以确定PCV2B依然是目前PCV2的优势流行毒株，提示在疫苗开发和病毒致病性研究方面应考虑到不同国家主要流行毒株基因型的差异，使研究更有针对性。

Cheung等对2005年美国3个州(Iowa、Kansas、North Carolina)分离的24个PCV2分离株进行序列分析发现[7]，其中21个分离株为PCV2B。PCV2基因型的这种变化，可能是由于PCV2A/B之间的毒力存在差异，PCV2B的毒力要强于PCV2A，虽然近年来引发美国等一些国家的猪场出现PCV2疫情暴发，但目前还没有十分确切的证据加以证明。也有研究表明，两者在毒力或致病性上无明显差异，但同一基因型内的不同分离株之间在毒力或致病性却有明显的差异[9]。

表1 1999年～2009年PCV2分离株基因型的变化Table 1 Genetic types variation of PCV2 isolates all over the world in 1999-2009

2.1.2 PCV2中国分离株基因型分析 郎洪武等的调查表明，国内猪群中存在PCV2的感染[10]。随后各地进行的大量检测工作发现，国内各类猪群中PCV2的感染可能比较普遍[11-15]。从2003年开始国内陆续有PCV2分离株的基因全序列报道，通过对国内2003年～2009年提交的PCV2分离株的序列分析表明，在统计年限内PCV2B均为主要流行毒株，特别是2007年～2009年分离株中PCV2B均占95%以上(表2)。在287个PCV2分离株中，PCV2B占250个，表明PCV2B是国内猪群中主要流行毒株；另外37个PCV2A分离株主要来自台湾、山东、甘肃等地，提示PCV2的基因型也存在地区差异。

表2 2003年～2009年PCV2中国分离株基因型的变化Table 2 Genetic types variation of PCV2 isolates in China in 2003-2009

2.1.3 国外PCV2分离株基因型分析 据文献报道1999年～2009年国外的PCV2分离株共269个，基因型分析表明，PCV2A在1999年～2003年、2005年和2009年均为优势毒株基因型，PCV2B在2004年、2006年～2008年为优势毒株基因型，这一结果与PCV2国内分离株的基因型变化存在差异(表3)。对分离株来源分析表明，PCV2基因型在不同国家情况也不同，如2005年后PCV2B在北美地区的检出率大大增加，这可能与此时猪群中PCV2疾病的暴发有一定的关联。

表3 1999年～2009年国外PCV2分离株基因型的变化Table 3 Genetic types variation of PCV2 isolates excluding China in 1999-2009

2.2 临床样品的检测

2.2.1 PCV2A和PCV2B PCR检测方法的建立 通过反应组份优化确定PCR最佳体系为20 μL：含(NH4)2SO4的 10×PCR 缓冲液 2.0 μL，MgCl2(25 mmol/mL)1.8 μL，dNTPs(10 mmol/mL)0.4 μL，TaqDNA 聚合酶(5 u/μL)0.3 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板 1.0 μL，灭菌超纯水补至 20 μL。PCR扩增条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s、56℃30 s、72℃40 s，40个循环；72℃10 min。

对PCV2A和PCV2B参考毒株的检测表明，设计的引物具有较高的特异性，PCV2A引物只能从PCV2A DNA模板中扩增得到一条约550 bp的片段，PCV2B引物只能从PCV2B DNA模板中扩增得到一条约330 bp的片段，同时用2对引物可从PCV2A和PCV2B混合DNA模板中得到各自特异性产物，无交叉扩增现象发生(图1)。重复性试验表明，建立方法重复性较好。PCR产物测序表明，产物的基因序列与模板DNA 100%相符(测序结果略)。

2.2.2 临床样品检测 用建立的PCR方法对70份临床样品进行检测，共检出PCV2阳性样品24份，占34.29%(24/70)。基因型分析表明，分离株均为PCV2B(24/24)，这一结果与国内的PCV2分离株基因型分析一致，提示在PCV2的流行规律、遗传变异以及致病性的研究方面，要结合病毒基因型分析，对不同基因型在PCV2相关疾病流行规律做进一步深入研究。

本研究对1999年～2009年PCV2分离株的基因型分析表明，PCV2B为当前的优势流行毒株，这种现象在国内尤为明显；国外PCV2的优势基因型存在地区差异，但PCV2B在引起PCV相关疾病中作用明显增强。以建立的PCV2A和PCV2B PCR方法对陕西杨凌地区采集的病料检测也表明，PCV2B为当地猪群中的优势毒株。本研究结果为PCV2相关疾病的防控提供参考依据。

[1]Mabe D,Banchard P,Truong C,et al.Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 Porcine circoviruses and indentification of immunorelevant epitopes[J].J Gen Virol,2000,81(7)：1815-1824.

[2]Allan G M,Ellis J A.Porcine circovirus:a review[J].J Vet Diagn Vest,2000,12:3-14.

[3]Muhling J,Raye W S,Buddle J R,et al.Genetic characterisation of Australian strains of porcine circovirus types 1 and 2[J].Aust Vet J,2006,84(12):421-425.

[4]Olvera A,Cortey M,Segales J.Molecular evolution of porcine circovirus type 2 genomes:phylogeny and clonality[J].Virology,2007,357(2):175-185.

[5]Gagnon C A,Tremblay D,Tijssen P,et al.The emergence of porcine circovirus 2b genotype(PCV-2b)in swine in Canada[J].Can Vet J,2007,48(8):811-819.

[6]Carman S,McEwen B,DeLay J,et al.porcine circovirus-2 associated disease in swine in Ontario(2004-2005)[J].Can Vet J,2006,47:761-762.

[7]Cheung A K,Lager K M,Kohutyuk O I,et al.Detection of two porcine circovirus type 2 genotypic groups in United States swine herds[J].Arch Virol,2007,152:1035-1044.

[8]温立斌，杨汉春，郭鑫，等.猪圆环病毒2型中国流行毒株的基因型分析[C].中国畜牧兽医学会2004年学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集，2004，42-46.

[9]Opriessnig T,Ramamoorthy S,Madson D M,et al.Differences in virulence among porcine virovirus type 2 isolates are unrelated to cluster type 2a or 2b and prior infection provides heterologous protection[J].J GenVirol,2008,89:2482-2491.

[10]郎洪武，程君生，张广川.猪断奶后多系统衰弱综合征[J].中国兽医杂志，2000，26(1)：3-5.

[11]王忠田，杨汉春，郭鑫.规模化猪场圆环病毒2型感染的流行病学调查[J].中国兽医科技杂志，2002，38(10)：53-56.

[12]祝卫国，党如意，杨增岐.陕西7个地区猪2型圆环病毒(PCV2)感染的血清学调查[J].中国兽医杂志，2007，43(7)：37-38.

[13]崔晓华，冷雪，黄海龙.猪圆环病毒型吉林株的分离与鉴定[J].吉林农业大学学报，2007，29(4)：433-436.

[14]杨汉春.盘点养猪2009之：我国主要猪病流行概况[J].猪业科学，2010，1：41-42.

[15]李龙，张奎.猪圆环病毒2型的血清流行病学调查[J].中国畜牧兽医，2010，37(1)：182-183.