食品中弓形虫和旋毛虫液相基因芯片检测方法的研究

杨朋欣，张子群，路义鑫，韩彩霞，李晓云，宋铭忻*

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江出入境检验检疫局，黑龙江 哈尔滨 150036)

弓形虫(Toxoplasma gondii)和旋毛虫(Trichinella spiralis)均为重要的食源性寄生虫[1]。人若进食含有以上2种寄生虫不同发育阶段的虫体或卵(囊)的食品，会导致发生食源性弓形虫或旋毛虫感染。弓形虫几乎可以感染各种温血动物，人感染弓形虫除影响生育外，还会引发多种疾病[2]。据报道，全球约10亿人感染弓形虫，我国感染人数达6000万[3-4]。旋毛虫为肉品卫生检验中的必检项目，人体感染旋毛虫严重者会导致心肌炎等疾病甚至死亡，我国旋毛虫感染高发区主要在云南、河南、湖北和东北三省[6-8]等地区。因此，加强食源性寄生虫的检测是十分迫切和必要的。

目前，我国诊断食源性寄生虫的方法较多，但是大多为一次仅检测一种虫体，在很大的程度上限制了食源性寄生虫的快速检测和鉴定。因此，有必要建立一种灵敏、特异、高通量的检测方法。液相基因芯片技术是美国Luminex公司开发的一种新型检测型生物芯片技术[5-6]，已应用于微生物检测等领域，具有高通量多指标同步分析、操作简便、灵敏性和重复性好等优点。本研究以弓形虫B1基因及旋毛虫18S rDNA基因为靶序列，设计特异性引物，建立高效、灵敏、特异的液相基因芯片检测方法，为食源性寄生虫的检测提供新方法。

1 材料和方法

1.1 虫株、载体与菌株 弓形虫基因组DNA由兰州兽医研究所惠赠；旋毛虫为本实验室保种；载体pMD18-T购自TaKaRa公司；大肠杆菌感受态菌株DH5α为本实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 链霉素-亲和素-藻红蛋白(SAPE)、表面羧基化的荧光编码微球购自上海透景生物科技有限公司；Luminex100液体悬浮点阵检测仪为美国Luminex公司产品。

1.3 探针及引物的设计与合成 根据GenBank登录的弓形虫B1基因(EU340879)和旋毛虫18S rDNA基因(AY497012)的序列，分别选择保守区域应用DNAStar软件设计探针，并根据探针位置，应用Primer5.0软件设计引物(表 1)。探针 5'端均添加poly T11尾并氨基化，同时将两条用于杂交的生物素标记的探针互补链作为阳性对照，上游引物5'端均采用生物素标记。探针和引物均由上海桑尼生物有限公司合成。

1.4 目的基因的克隆与重组质粒的鉴定 采用试剂盒方法提取旋毛虫基因组DNA，分别以弓形虫和旋毛虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，设阴性对照，反应条件为：95℃5 min；94℃30 s、58℃30 s、72℃40 s，30个循环；72℃10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。目的片段经过纯化分别克隆到pMD18-T载体中，并转化感受态细胞DH5α，PCR方法筛选阳性重组质粒，测序鉴定。

表1 引物和探针序列及扩增产物大小Table 1 The sequences of primers and probes and the size of product

1.5 双重PCR反应 以两种虫体基因组DNA为模板，进行双重PCR扩增，反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(各 2.5 mmol)2.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)为弓形虫各 0.5 μL、旋毛虫各0.8 μL，模板 DNA 各 0.5 μL，rTaqDNA 聚合酶0.5 μL。反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s、58.5℃ 30 s、72℃ 45 s，30个循环；72℃ 8 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定双重PCR产物。

1.6 液相基因芯片的制作 购置表面带有活性羧基化基团编号为35和38的两种微球，将B1基因探针和18S rDNA基因探针分别与35号和38号微球耦联，命名为Ⅰ和Ⅱ，耦联步骤由上海透景生物有限公司完成，并采用生物素标记的探针互补链测定耦联率。

1.7 液相基因芯片检测体系的建立 分别取单重和多重 PCR 产物各 3 μL，加入 7 μL TE 溶液和 20 μL稀释的微球溶液，95℃变性5 min，50℃孵育20 min，加入80 μL荧光素，50℃孵育20 min，于Luminex100液体悬浮点阵检测仪读取各微球检测的荧光强度值。

1.8 重复性试验 采用PCR方法分别扩增弓形虫和旋毛虫的基因组DNA，以液相基因芯片体系检测各PCR产物荧光强度，在相同的试验条件下重复6次，并对结果进行分析，验证本方法的重复性。

1.9 特异性试验 分别以弓形虫和旋毛虫引物扩增弓形虫、旋毛虫、猪囊尾蚴(Cysticercus cellulose)和华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的基因组DNA，应用液相基因芯片体系检测各PCR产物的荧光强度，并对结果进行分析，验证本方法的特异性。

1.10 敏感性试验 对弓形虫和旋毛虫PCR扩增产物进行2-n倍比稀释，每种产物稀释12个梯度，分别应用琼脂糖凝胶电泳和液相基因芯片体系检测，比较两者的敏感性。

1.11 人工模拟污染试验 分别提取弓形虫、旋毛虫和检疫合格猪肌肉组织的基因组DNA，将猪基因组DNA分装入30个EP管中：其中20个管加入一种虫体基因组DNA；8个管加入两种虫体的混合基因组DNA；另外2个管为对照组。将30个EP管随机编号，应用弓形虫和旋毛虫的混合引物分别扩增，对液相基因芯片检测结果进行分析。

2 结 果

2.1 目的基因的克隆与重组质粒的鉴定 应用PCR方法分别从弓形虫与旋毛虫基因组DNA中扩增出约200 bp和100 bp的DNA片段(图l)，与预期大小相符。测序结果显示，弓形虫B1基因和旋毛虫18S rDNA基因与GenBank登录的相关基因相似性分别为99.47%和100%，表明目的片段已插入克隆载体中，构建了弓形虫和旋毛虫的重组质粒。

2.2 双重PCR扩增 应用双重PCR方法由弓形虫与旋毛虫混合基因组DNA中扩增出约200 bp和100 bp的DNA片段(图2)，与预期大小相符，表明双重PCR扩增产物正确。

2.3 液相基因芯片体系检测结果 应用生物素标记的探针互补链测定液相基因芯片Ⅰ和Ⅱ，检测耦联率较高，表明Ⅰ和Ⅱ可以在该体系中应用。液相基因芯片体系检测单重PCR和双重PCR产物结果表明：阴性和阳性的荧光强度检测值与琼脂糖凝胶电泳结果一致(图略)，两种虫体检测过程的信噪比分别为72.72和75.11，表明荧光信号值明显高于背景值，视为有效结果；双重PCR产物检测结果与单重PCR产物检测结果一致(表2)。

表2 液相基因芯片检测PCR产物Table 2 PCR products detected by liquid gene chip

2.4 重复性试验 在相同试验条件下，重复检测6次，计算各批间平均荧光强度值的变异系数(CV)。重复性检测结果显示各变异系数均在7%以内(表3)，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。

表3 液相基因芯片检测单重PCR产物重复性试验Table 3 Reproducibility tests of liquid gene chip for PCR products

2.5 特异性试验 特异性检测结果显示，扩增虫体混合基因组DNA的PCR产物荧光强度值呈阳性，而扩增猪肉基因组DNA的PCR产物荧光强度值均呈阴性(表4)，表明该方法具有较好的特异性。

表4 液相基因芯片特异性试验Table 4 Specificity tests of liquid gene chip

2.6 敏感性试验 比较液相基因芯片体系和琼脂糖凝胶电泳检测结果的灵敏性，结果表明液相基因芯片体系比琼脂糖凝胶灵敏度高约8倍，检测弓形虫和旋毛虫的最低限可达原液的2-8(图3)和2-9(图4)，灵敏度分别为65.6 ng/mL和53.52 ng/mL。

2.7 人工模拟污染试验结果 应用建立的液相基因芯片体系检测30个随机编号的待检样品，结果显示30份样品中阳性率为90%(27/30)；阴性率为7%(2/30)；阳性检出率为96%；阴性检出率均为100%，盲测结果准确率达98%以上，与预期的结果基本相符，表明该方法在实际操作中具有一定的可行性。

图4 液相基因芯片检测旋毛虫灵敏度结果Fig.4 Specificity test of T.spiralis

3 讨论

近年来，尽管建立了多种食源性寄生虫的检测方法，但均为“单一”法，本研究建立的液相基因芯片方法打破了传统“一对一”的检测方式，可快速进行高通量、多指标同步分析，为特异性强、灵敏性和重复性好的新方法。

在建立方法过程中，基因的选择和探针的设计至关重要。核糖体DNA(rDNA)是细胞核内编码核糖体RNA的基因，为一类中度重复序列，每个重复单位由非转录间隔区(NTS)、内转录间隔区(ITS)和3种核糖体基因编码区(18S、5.8S、28S)组成[7]，不同区域进化速率不同，而且十分保守。因此，本研究选择旋毛形线虫18S基因作为检测的靶基因。虽然弓形虫B1基因的生物学功能尚不清楚，但该基因是一种多拷贝基因，并且序列高度保守，是目前鉴定弓形虫最为理想的目的基因之一[8]。本方法能够特异地对弓形虫和旋毛虫PCR产物进行检测，检测的线性范围广，检测荧光强度的CV值控制在统计学有效范围内，本实验结果均证明该方法具有良好的稳定性。在验证液相基因芯片灵敏度时，发现PCR产物初始浓度的荧光值并非最高，而是随浓度的降低呈先升高后下降的趋势，这种变化在其它文献中尚未报道，暂将其称作液相基因芯片所需PCR产物的最适浓度。虽然本研究在人工模拟污染试验中取得较好的结果，但在检测实际样本方面，还有待进一步验证。总之，液相基因芯片技术的开发及应用将改变食源性寄生虫检测的现状，该方法的建立为食源性寄生虫的检测提供了实验依据。

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