鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株VP2基因突变对细胞嗜性改变的研究

高 立，祁小乐，高玉龙，高宏雷，秦立廷，邓小芸，李 凯，王笑梅

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD病毒(IBDV)引起的一种危害鸡的急性、高度接触性传染病[1]。超强致病性IBDV(vvIBDV)经传代致弱能够感染非允许细胞鸡胚成纤维细胞(CEF)，通过病毒碱基突变不仅有助于了解IBDV的遗传变异机制，而且对于研发新型疫苗意义重大。近年来，IBDV遗传变异和细胞嗜性等分子基础研究取得了一些进展[2-4]。VP2被认为是决定病毒细胞嗜性的基因[5-6]，然而，其具体的分子机制尚存在争议。我国在这方面的研究尚未见报道。本课题组利用已建立的IBDV反向遗传操作系统[7]，对IBDV细胞嗜性的分子基础进行分析和预测。本研究借助该操作技术，对国内地方分离的vvIBDV，通过定点突变和重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术，研究定位vvIBDV的VP2基因突变对细胞嗜性改变的影响。

1 材料和方法

1.1 重组质粒及单克隆抗体(MAb) 重组质粒pT-HLJ0504A、pT-HLJ0504B(分别含有 vvIBDV分离毒株HLJ-0504全基因组的A、B节段)由本课题组构建保存；IBDV VP2 MAb由本课题组制备。

1.2 主要试剂 DpnⅠ酶购自NEB公司；Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司；LipofectamineTM2000和SuperscriptTMRT-PCR Systems试剂盒购自英俊生物技术有限公司；Opti-MEMⅠMedium购自GIBCO公司；FITC标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。

1.3 引物设计与合成 实验中所用引物见表1，引物由英俊生物技术有限公司合成。

1.4 感染性分子克隆的构建

1.4.1 核酶结构的引入 参考文献[7]的方法，以AU01/AL01、AU02/AL02和AU02/AL03为引物，分3步在基因组A节段的5'端引入HamRz(5'-TGTT AAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATA GGAAAGGAATTCCTATAGTC-3')，3'端引入 HdvRz(5'-GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGT CCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG-3')。将最终PCR产物命名为HLJ0504AHRT。将其克隆于pMD18-T载体，重组质粒命名为pT-HLJ0504AHRT。用引物BU01/BL01、BU02/AL02和BU02/BL03以同样方法在基因组B节段两端引入核酶结构，将最终PCR产物命名为HLJ0504BHRT。

1.4.2 突变位点的引入 参考文献[7]中点突变方法，以pT-HLJ0504AHRT为模板，GxA889TU/Gx-A889TL，GxG980AU/GxG980AL为引物(表1)。在A节段上同时引入核苷酸突变A889T、G980A，即分别在VP2上引入氨基酸突变Q253H和A284T，突变后的重组质粒命名为pT-HLJ0504A889/980HRT。

表1 引入突变、核酶结构和RT-PCR的引物Table 1 Primers for mutation,ribozyme sequences introduction and RT-PCR

1.4.3 全基因组克隆的构建 用SacⅠ和KpnⅠ分别处理HLJ0504AHRT、pT-HLJ0504A889/980HRT和真核表达载体pCAGGS，纯化后分别连接。测序鉴定正确的重组质粒分别命名为pCAGGHLJ 0504AHRT、pCAGGHLJ0504A889/980HRT(图 1)。

用ClaⅠ和XhoⅠ处理HLJ0504BHRT，与经相同酶酶切处理的pCAGGS载体连接，将测序正确的重组质粒命名为pCAGGHLJ0504BHRT(图1)。

1.5 病毒拯救及鉴定 提取重组质粒，参考文献[7]的方法，将含A、B节段的重组质粒共转染DF1细胞进行病毒拯救，在CEF细胞上盲传直至产生细胞病变(CPE)。转染分两个组：pCAGGHLJ-0504AHRT和 pCAGGHLJ0504BHRT； pCAGGHLJ-0504A889/980HRT和pCAGGHLJ0504BHRT。同时设立只转染空载体pCAGGS作为空白对照。

图1 重组质粒示意图Fig.1 Schematic diagram of the recombinant plasmids

1.5.1 间接免疫荧光检测(IFA) 将拯救病毒感染CEF，16 h后无水乙醇固定细胞，1∶100稀释IBDVVP2 MAb为一抗，作用1 h。以1∶100稀释FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，作用1 h，PBST洗涤后荧光显微镜观察结果。同时设置阴性对照。

1.5.2 电镜观察 将收获的拯救病毒细胞悬液反复冻融3次，3000 r/min于4℃离心10 min，取上清12000 r/min于4℃离心10 min，适量PBS重悬沉淀，负染电镜观察。

1.5.3 RT-PCR鉴定 按SuperscriptTMRT-PCR Systems试剂盒说明书，取第4代细胞毒提取总RNA，以引物AU/F6VP2Q1512L和BU/B1344L分别RT-PCR扩增A、B节段的部分片段进行检测，并进行测序鉴定。

1.6 拯救病毒复制动力学研究 按常规方法滴定拯救病毒的TCID50效价。以104TCID50拯救毒接种CEF单层，分别于感染后每隔12 h取细胞上清，滴定其TCID50效价；重复测定3次，取其平均值，绘制病毒复制动力学曲线。

2 结 果

2.1 感染性分子克隆的构建 A、B节段经突变及引入核酶结构后，经PCR扩增分别获得约为3400 bp和3000 bp，与预期(3426 bp和2985 bp)结果相符(图 2)。构建的重组质粒 pCAGGHLJ-0504AHRT、pCAGGHLJ0504A889/980HRT经SacⅠ/KpnⅠ双酶切后获得片段，与预期大小相符(图略)。重组质粒pCAGGHLJ0504BHRT经ClaⅠ/XhoⅠ酶切鉴定完全正确(图略)。进一步的 pCAGGHLJ0504-AHRT、pCAGGHLJ0504A889/980HRT和pCAGGHLJ-0504BHRT克隆全长测序显示，双点突变、核酶结构引入及开放阅读框完全正确。

2.2 病毒拯救 pCAGGHLJ0504A889/980HRT与pCAGGHLJ0504BHRT共转染组，在CEF上传第2代时，可见极轻微CPE；第2代以后，均可见较明显CPE；接毒后72 h，细胞碎裂但不悬浮，折光性增强，呈砂砾状。pCAGGHLJ0504AHRT与pCAGGHLJ0504BHRT共转染组重复转染5次，并在细胞上连续盲传5代以上，均没有观察到任何CPE。将pCAGGHLJ0504A889/980HRT和 pCAGGHLJ0504-BHRT共转染获得的拯救毒命名为rHLJ-0504HT。

2.3 拯救毒的鉴定 rHLJ-0504HT感染CEF后IFA可检测到特异荧光信号(图3)。电镜下可观察到rHLJ-0504HT细胞培养物上清中有直径60 nm左右、无囊膜的病毒粒子，这与IBDV特有的形态结构一致(图略)。而 pCAGGHLJ0504AHRT和 pCAGGHLJ-0504BHRT共感染组的细胞悬液接种CEF后IFA为阴性，电镜下也没有观察到病毒粒子，没有获得拯救病毒。

2.4 拯救病毒RT-PCR鉴定 从rHLJ-0504HT第4代毒中扩增A、B节段部分片段，获得了预期大小约为1400 bp、1340 bp的片段(图略)。测序结果显示：A节段存在突变位点T889和A980，A、B节段的其余部分与亲本毒HLJ-0504序列完全一致。

2.5 复制动力学研究 依据感染CEF后不同时间段细胞培养液中病毒的TCID50效价，绘制了拯救病毒rHLJ-0504HT的复制动力学曲线(图4)。接毒后12 h可检测到病毒；24 h达到病毒复制平台期，平台期病毒的效价均在105TCID50/mL以上；在接毒的前48 h内，病毒的效价呈上升趋势，但是上升幅度较小；接毒60 h后，拯救病毒的效价开始有所下降，下降幅度也较小。

图4 拯救病毒rHLJ-0504HT复制动力学曲线Fig.4 The replication kinetics curve of the rescued rHLJ-0504HT

3 讨论

IBDV变异和细胞嗜性的分子基础研究表明，VP2决定IBDV的细胞嗜性[5-6]。通过定点突变，将影响IBDV细胞嗜性的分子基础进一步集中在了VP2高变区253位、284位、279位和330位氨基酸上。除330位氨基酸一致认为与IBDV细胞嗜性无关外，253位、284位和279位氨基酸与IBDV细胞嗜性的关系，则存在较大的异议[8-12]。为了进一步研究和定位vvIBDV细胞嗜性改变的分子基础，本研究利用反向遗传操作技术和定点突变技术，对vvIBDV HLJ-0504株进行了定点突变和病毒拯救。亲本病毒HLJ-0504由于不能适应CEF，共转染其基因组不能获得拯救病毒。而将其A节段VP2中的两个氨基酸位点进行突变(Q253H/A284T)后，与其B节段共转染可以获得拯救病毒。因此，双位点氨基酸突变改变了vvIBDV的细胞嗜性，使其适应CEF细胞。证明VP2的253位和284位氨基酸决定vvIBDV的细胞嗜性。

VP2的晶体结构显示，VP2亚单位分为3个明显的部分，即B(Bas)区、S(Shell)区和P(Projection)区，其中P突出于病毒粒子的最表层[13-14]。运用在线软件Swiss Model对IBDV的VP2蛋白进行同源建模分析发现：253和284两个氨基酸残基位于VP2蛋白的P(projection)区的突出部位，253位于PDE loop，284位于 PFG loop。PDE loop和 PFG loop被认为与病毒-受体结合密切相关[14]。其中VP2 Q253H的突变将使线性的氨基酸变为有环状结构的氨基酸，增加了β转角形成的可能性；而A284T的突变使非极性的疏水氨基酸变为极性的亲水氨基酸，增加了β折叠形成的可能性，而且还增加了一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化潜在位点。所以253位和284位两个氨基酸残基的改变极有可能造成病毒配体分子结构的改变，进而改变病毒与宿主细胞受体的结合状态和类型，最终改变病毒的细胞嗜性。

本研究首次利用我国vvIBDV分离超强毒株，采用反向遗传操作系统证明：VP2的253位和284位氨基酸决定了IBDV的细胞嗜性。本研究不仅有助于了解IBDV的遗传变异机制，而且对于研发新型疫苗提供了实验依据。

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