SSH技术在丝状真菌功能基因筛选中的应用

张蕾蕾　余永涛　何生虎　葛松

摘要：抑制性消减杂交（SSH）技术是基于抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法。因其具有特异性高、假阳性率低、背景低、快速高效等特点，已广泛应用于丝状内生真菌功能基因筛选中。主要对抑制性消减杂交技术的原理、技术流程、特点及其在丝状真菌生长发育、代谢活性物质及致病基因等方面的应用作简要综述。

关键词：抑制性消减杂交（SSH）技术；差异基因；丝状真菌；筛选

中图分类号：Q949.32；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0500-05

近年来随着分子生物学的不断发展，差异表达基因已逐渐成为功能基因组学研究的热点，分离、克隆、敲除某些具有特定功能的差异表达基因可为进一步揭示生物性状的调控机制奠定基础。目前，用于差异表达基因研究的技术主要有差异显示PCR （Differential display PCR，DDRT-PCR）、代表性差异分析PCR（Representational difference analysis PCR，RDA-PCR）、抑制性消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术、互补脱氧核糖核酸扩增片段长度多态性技术（DNA amplified fragment length polymorphism，cDNA-AFLP）、cDNA微阵列（cDNA microarray）技术、限制性酶切片段差异显示（Restriction fragment differential display PCR，RFDD-PCR）。其中SSH技术是一种以抑制性PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的高效分离差异表达基因技术。该技术具有操作简便、特异性高、假阳性率低、灵敏度高、重复性好、周期性短、背景低、一次可同时分离上百个差异基因等优点，因其独特的优越性而被广泛应用于差异表达基因的研究中。丝状真菌是传统发酵工业中抗生素、酶制剂和有机酸的主要生产者，在自然界中扮演着各种复杂有机物分解者的角色，也是植物和动物疾病的主要病原微生物，研究与丝状真菌物质代谢、合成、致病相关的差异表达基因，可为进一步筛选丝状真菌的功能基因，并阐明其在各种生物过程中的调控机制提供理论依据。近年来，SSH技术凭借其独特的优越性，被广泛应用于丝状真菌物质代谢、合成、生长发育及致病相关基因等的研究中。本文主要对SSH技术在丝状真菌差异表达基因的研究和应用进行综述。

1 SSH技术

1.1 SSH技术的原理

SSH技术是由Diatcheuko等[1]发现的一种比较和分离不同细胞系、不同组织间或同一细胞系、同一组织间在不同条件下的差异表达基因的技术。SSH以抑制性PCR技术为基础，并与均一化和消减杂交技术相结合，在非目的双链DNA片段两端连接相同的接头，使其具有反向末端重复序列，从而抑制非目的片段的扩增，以达到选择性扩增目的片段的目的。均一化可保证低丰度差异表达基因不被丢失，而高丰度差异表达基因又不被过量分离。消减杂交则可以消除试验组（Tester）与对照组（Driver）的同源序列，形成一种e型分子（e型分子的两个5′端有两个不同的接头），从而确保差异表达基因片段进行指数扩增。

1.2 SSH技术的基本步骤

SSH技术主要包括cDNA合成与酶切、接头连接、两轮消减杂交和两轮选择性PCR扩增等步骤。首先分别提取试验组和对照组总RNA、纯化mRNA，反转录mRNA合成双链cDNA。用Rsa Ⅰ等内切酶分别将两组cDNA酶切，使其变为平均长度为600 bp左右的平末端双链cDNA片段。然后将酶切后的试验组cDNA分为两份，一份与接头1连接，另一份与接头2连接。再分别向连接不同接头的试验组cDNA中加入过量的对照组cDNA，进行第一轮消减杂交，杂交完毕后形成a、b、c、d 4种产物，a是单链试验组cDNA，b是自身退火的试验组双链cDNA，c是试验组和对照组的异源双链cDNA，d是对照组cDNA。在两份第一轮杂交产物中分别再加入新鲜变性对照组cDNA进行第二轮杂交，进一步消除试验组和对照组共有序列。第二轮杂交完毕后，将接头补平，然后进行两轮选择性PCR。第一轮PCR以接头外侧序列为引物结合位点，其中只有差异表达基因目标片段形成的e型分子以指数级大量扩增，而其他分子不能扩增或只能线性扩增；第二轮PCR扩增时，以接头内侧序列为引物结合位点，进一步选择性扩增目标片段，从而极大提高扩增的特异性并降低非目的片段的背景干扰，使最终的PCR产物中绝大部分为e型分子。

1.3 SSH技术的优点与缺点

SSH技术具有操作简便、快速高效、假阳性率低等优点。该技术克服了差异显示、代表性差异分析等技术假阳性率高、杂交次数多等缺陷，可同时分离数十个甚至数百个差异表达基因，经过一轮消减杂交，即可实现对差异表达基因1 000～5 000倍的富集，筛选周期相对其他基因分离方法大大缩短。SSH技术还可保证高、低丰度差异表达基因都能有效分离，克服了差异显示法中低丰度差异表达基因不易被分离的缺点。高富集度、低背景和消减混合物中cDNA丰度的均一化也是抑制性消减杂交技术成为快速克隆差异表达基因的理想方法的主要原因之一。SSH技术与其他基因分离技术相比也存在一些不足。SSH技术一次不能同时进行数个样本之间的分析研究，它不适于检测较复杂和cDNA较长的样本的差异表达基因。在消减杂交过程中，消减文库中cDNA已经被酶切，不再是全长cDNA，给差异表达基因全长cDNA序列的获得带来较大难度和巨大的工作量；SSH技术无法筛选出完全无酶切位点或酶切位点较少的基因片段，非酶切位点区域内出现的点突变、小缺失或插入序列也不能被有效地发现。

2 SSH技术在丝状真菌研究中的应用

2.1 SSH技术在丝状真菌物质合成和代谢相关基因筛选中的应用

丝状真菌是传统发酵工业中抗生素、酶制剂和有机酸的主要生产者，研究调控丝状真菌物质合成和代谢相关的基因是丝状真菌研究的核心问题。近年来国内外对部分丝状真菌的差异表达基因展开了一系列研究，为进一步获得丝状真菌物质合成和代谢调控相关功能基因提供了大量备选基因，在丝状真菌生物合成研究和应用中具有重要意义。赖卫华等[2]对红曲菌（Monascus aurantiacus）进行诱导培养，选育出不产橘霉素和高产橘霉素的菌株，应用SSH技术构建出红曲菌的消减cDNA文库，转染大肠杆菌进行文库扩增，文库扩增后得到283个克隆个体，为进一步筛选红曲菌中与产橘霉素性状相关的基因奠定了重要基础。Chi等[3]应用SSH技术研究了紫杉醇产生菌树状多节孢（Nodulisporium sylviforme）在调控紫杉醇合成中的作用，为进一步揭示真菌合成紫杉醇的调控机制提供了重要依据。为了选育遗传性状稳定且高产的紫杉醇菌株，赵凯等[4]分别采用硫酸二乙酯和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变处理菌株HD1-3孢子，成功地构建了高产紫杉醇菌株UD11-14与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库，为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇相关基因和利用基因工程或代谢工程手段定向设计改造菌株奠定了基础。Jochen等[5]应用SSH技术研究齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）中合成硬葡聚糖的调控基因，最终分离出调控硬葡聚糖合成的基因，加快了齐整小核菌物质合成、代谢机制研究的进程，为进一步阐释该真菌在物质合成、代谢过程中与宿主相互作用关系提供了依据。王丹枫等[6]以深黄被孢霉（Mortierella isabellina）高产诱变菌株和原始菌株为试验材料，采用SSH技术成功构建了深黄被孢霉高产诱变菌株差异表达文库，为高产诱变菌株表达基因的筛选和鉴定提供了备选基因文库。为了阐释黑曲霉（Aspergillus niger）产糖化酶的分子机理，朱俊晨等[7]以蓝光诱导黑曲霉，采用SSH技术构建了蓝光诱导的黑曲霉消减cDNA文库，并通过文库筛选和测序获得了包括糖化酶在内的13个功能基因。Xu等[8]采用SSH技术研究灵芝（Ganoderma lucidum）细胞在静置培养和振荡培养中单体灵芝酸的合成，并进一步鉴定差异表达的基因，对于了解灵芝酸的生物合成途径、进一步探讨灵芝酸合成的调控机制及构建高产灵芝酸的工程菌株具有重要意义。

为了分离和鉴定黑曲霉木聚糖代谢相关基因，朱汇源[9]应用SSH技术成功构建了黑曲霉木聚糖诱导正向消减文库，获得了大量木聚糖代谢相关酶的基因， 该研究对优化黑曲霉的发酵、 产酶过程及菌株的定向遗传改造具有重要的推动作用。Castillo等[10]为了研究产青霉菌在以葡萄糖和乳糖为碳源的条件下，全基因序列中影响菌体代谢差异表达的基因，应用SSH技术研究在不同碳源媒介中的差异基因，其研究结果为进一步研究产青霉菌在不同碳源下的代谢机制提供了理论基础。Wu等[11]应用SSH技术研究担子菌（Phanerochaete chr- ysosporium）在初级代谢和次级代谢转换中差异表达的基因，成功构建了担子菌在代谢转换中差异基因的cDNA文库。

2.2 SSH技术在丝状真菌生长发育调控基因筛选中的应用

Zhang等[12]应用SSH技术成功分离出红曲霉（Monascus pilosus）突变株MK-1和原始菌株红曲霉IFO4520差异表达基因，并对MK-1突变株的30个上游表达序列标签进行鉴定，其中10个上游表达序列标签与编码红曲霉生长发育中4-磷酸磷脂酰肌醇-5-激酶转录蛋白的功能基因相一致，其结果推动了红曲霉突变株中合成色素基因的研究。为了研究金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）微循环产孢的分子机制，张石柱[13]以微循环产孢时期的绿僵菌为试验组，以正常产孢时期的绿僵菌菌丝为对照组，利用SSH技术成功构建了绿僵菌CQMa102 微循环产孢时期的差减文库，并对差减文库进行了筛选，最后用生物信息学方法对得到的ESTs（Expression sequence tag）进行分析，比较其与数据库中已知蛋白序列的同源性， 进一步研究ESTs编码蛋白的功能，CQMa102微循环产孢方式奠定了理论基础。Peng等[14]应用SSH技术分离促进绿僵菌产孢的正调节基因，其研究结果推动了从分子水平上研究绿僵菌的产孢机制。Gesing等[15]为了研究丝状真菌子实体分化受哪些基因控制，采用SSH技术构建不同性别和生长发育时期的火丝菌（Pyronema）的差异消减cDNA文库，比较不同性别和生长发育时期的火丝菌的差异表达基因，这一研究为丝状真菌生长发育中调控基因的研究奠定了基础。Xu等[16]采用SSH技术系统研究灵芝在振荡培养和静置培养下的差异表达基因，成功构建了差异基因的cDNA文库，并分离出编码灵芝发育中一些功能氨基酸的基因，而这些基因合成的氨基酸与促分裂源活化蛋白激酶具有相似功能，静置培养中，这一基因高度表达。这一研究为进一步系统地从分子水平上研究灵芝促丝裂原活化蛋白激酶的功能提供了理论基础。Gras等[17] 为了研究在磷酸盐缺乏条件下培养的nuc-2A突变粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的转座子差异表达，采用SSH技术成功构建了突变菌株和正常菌株在磷酸盐缺乏条件下的抑制消减cDNA文库，推动了从基因组学上研究磷酸盐在粗糙脉孢菌生长发育中的作用。Van der nest等[18] 为了研究Amylostereum areolatum中植物的不相容性基因，应用SSH技术构建处于各个时期的细胞的消减cDNA文库，其研究结果为进一步研究担子菌纲丝状真菌的不相容性提供了理论基础，在Amylostereum areolatum的研究中起到尤为重要的作用。姜华等[19]利用SSH技术从稻瘟菌继代接种菌株间分离出了差异表达基因，研究发现尽管这些菌株表型上没有明显差异，但在分子水平上仍然可能存在着变化，基因本体论分类表明这些EST序列对应蛋白的功能涉及生命活动的诸多方面，其中合成相关蛋白最多，其次是传导相关蛋白，这些蛋白参与了细胞的生长发育信号感知等生物过程。周汛等[20]应用SSH技术成功构建了高特异性的申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）菌丝相和酵母相的正反cDNA消减文库，并对其差异表达的基因进行了生物信息学分析，以探讨差异表达基因与酵母相以及与菌丝相双相转换的相关性。其研究结果为进一步筛选鉴定菌相转换相关差异基因奠定了基础，有助于阐明申克孢子丝菌双相转换的分子机制。谭玉梅等[21]为鉴定谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因，采用SSH技术以低渗条件下产生的子囊孢子和高渗条件下产生的分生孢子为材料分别与营养菌丝体构建两个正反向文库，筛选可能参与有性产孢调控的基因13条，可能参与无性产孢调控的基因10条，为进一步研究谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因提供了基因文库。

2.3 SSH技术在丝状真菌致病基因筛选中的应用

丝状真菌是植物和动物的一类重要致病菌，能够导致植物和动物发病以及粮食等贮藏过程中的腐败变质，带来的经济损失难以估量。SSH技术广泛用于一些丝状真菌致病基因的研究中。在丝状真菌致病基因的研究技术中，SSH技术可以建立完整的基因文库，减少Southern blot、PCR、DNA测序、RACE等技术大批量筛选、克隆致病基因的盲目性，极大地提高了特异性。殷从松[22]应用SSH技术构建了金龟子绿僵菌在蝗虫体内特异表达基因的差减文库，推动了金龟子绿僵菌致病相关基因Mmnt1和Mpt的克隆及功能分析的进一步发展。赵国庆[23]应用SSH技术比较糠秕马拉色菌的菌丝态和酵母态之间的mRNA差异，分析糠秕马拉色菌的菌丝态和酵母态的基因表达差异，了解其酵母态转化为菌丝态的相关分子机理，成功建立了糠秕马拉色菌菌丝态和酵母态细胞的差异表达cDNA文库，为进一步深入研究糠秕马拉色菌的致病机制奠定了基础。Maranhao等[24]为了研究红色毛廯菌侵入机体、致使机体致病的机理，应用SSH技术分离以机体脂质为碳源的红色毛廯菌过度表达的基因，结果发现假定合成蛋白类的基因与参与真菌蛋白类代谢、信号传递、防御等功能的基因相似。Liu等[25]为研究硫化羰在控制植物致病中的作用，以经过硫化羰熏蒸过的互隔交链孢霉（Alternaria alternate）菌株为试验组，未熏蒸过的菌株为对照组，应用SSH技术分离、克隆试验组和对照组中差异表达的基因，其结果为系统研究硫化羰控制植物致病性提供了坚实的理论依据。Kim等[26]以感染稻瘟病菌的植株为试验组，未感染稻瘟病菌的植株为对照组，应用SSH技术对稻瘟病菌的群体结构和变异基因进行了研究。刘同宝[27]利用SSH技术构建稻瘟病菌发育24 h附着胞与稻瘟病菌菌丝/孢子cDNA的差减文库，进一步应用RT-PCR技术验证在稻瘟病菌附着中特意表达的基因，研究结果表明构建的cDNA文库在筛选稻瘟病菌附着胞特异表达基因中取得了很好的结果，为应用SSH技术筛选稻瘟病菌附着胞特异表达基因奠定了基础。姜兆远等[28]为鉴定及分析水稻抗稻瘟病SSH-cDNA抗性文库中差异表达基因，应用SSH技术成功构建了水稻抗稻瘟病SSH-cDNA抗性文库，筛选出与已知功能蛋白同源性较高的基因序列，该研究为控制和防治稻瘟病提供了新的理论和途径。胡海燕[29]利用SSH技术分离水稻对穗瘟防卫反应相关基因，并根据信息学对筛选的差异基因的功能进行研究，该研究为水稻对穗瘟防卫反应相关基因的进一步筛选提供了依据。陈涛[30]试图从水稻的T-DNA突变体中找到水稻纹枯病的抗性相关基因，应用SSH技术构建了经纹枯病菌诱导表达的正向和反向抑制差减，为筛选水稻纹枯病的抗性相关基因提供了基因文库。

2.4 SSH技术在丝状真菌毒物降解相关基因筛选中的应用

丝状真菌（如白僵菌、绿僵菌、哈氏木霉等）在工业污染物防治中发挥了重要作用。姚琳[31]通过SSH技术构建哈茨木霉诱导菌丝体cDNA文库，从整体上了解在诱导抗病过程中哈茨木霉抗性相关基因的表达情况及抗病机制的运行，为进一步利用这些基因奠定了基础。Faedda等[32]采用SSH技术研究哈茨木霉吸附土壤中重金属的机制，发现人工诱导的重金属环境下，哈茨木霉的基因出现明显的差异，为进一步分离、克隆哈茨木霉中降解重金属基因奠定了基础。Puglisi等[33]采用SSH技术鉴定哈茨木霉菌在一价和二价汞的处理下培养基因的差异表达。结果分离出8个差异表达基因，这8个基因与哈茨木霉降解一价和二价汞离子的能力呈正相关，为从分子水平上系统研究哈茨木霉降解土壤中重金属的机制提供了理论基础。

3 展望

SSH技术凭借其特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点，被广泛应用于生命科学和医学等各个领域差异表达基因的系统研究中。然而SSH技术仍然存在不足之处，如SSH技术不能应用于完全无酶切位点的基因片段或酶切位点较少的基因组，一些低丰度变化的细胞因子、转录因子等不能通过这种方法被检出，SSH技术一次只能对复杂且具有细微差异的两个样品之间的差异表达的基因进行比较，不能同时进行数个样本之间的分析研究，需要较多的起始材料等。在后续的研究中，应将SSH技术与其他的研究差异表达基因技术结合起来应用，从而提高筛选的范围和准确性。与cDNA微阵列技术、反向Northern杂交技术、实时定量PCR技术、RACE技术、基因组比较分析法（Genomic comparative analysis）等技术联合使用，实现多种技术的优势互补，以达到高效、灵敏和特异性地分离鉴定差异表达基因的目的。近年来，随着SSH技术的发展，SSH技术已经广泛应用于丝状真菌的物质合成、代谢、生理发育调控基因、致病基因、降解工业毒物基因的研究中，推动从分子水平上对于丝状真菌功能基因的研究，选育出对人类生活起积极作用的高产丝状真菌，敲除危害丝状真菌宿主植物的有害基因，使丝状真菌更好地服务于人类。

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