猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

张维军，田 野，林 燕，王 群，徐青元，孙庆歌，刘霓红，杨 涛，田志军，步志高，童光志，李文京，吴东来*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起猪的一种高度传染性疾病，临床以母猪发热、厌食和流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征[1-3]。20世纪90年代以来，PRRSV几乎已传播到世界上所有养猪的国家，严重阻碍了养猪业的发展。目前使用的灭活苗和弱毒苗存在某些不足，如弱毒疫苗有可能出现返祖现象，而灭活苗虽安全性较高但其效果远不如弱毒苗等[4]。PRRSV具有3个重要的结构蛋白：E蛋白、M蛋白和N蛋白，这3个蛋白分别由病毒基因ORF5、ORF6和ORF7编码[5-8]，其中M蛋白是膜基质蛋白，为非糖基化蛋白，在PRRSV结构蛋白中最为保守，具有较强的免疫原性，可诱导产生中和抗体和特异性细胞免疫应答[6-7]，而且与GP5蛋白诱导的免疫反应可能与感染猪清除体内PRRSV有关[9]。张治涛等的研究表明，重组腺病毒表达的M蛋白、GP5及其两者的融合蛋白对猪具有较强的免疫效力[10]。这些资料均表明，M蛋白在刺激机体产生免疫方面具有重要意义。

痘苗病毒作为载体有许多优点：感染几乎所有源于哺乳动物的培养细胞；外源蛋白的表达效率较高而且在感染细胞中能有效地进行修饰等[11-19]。因此，痘苗病毒载体被广泛用于分子生物学、细胞生物学、免疫学领域以及新型疫苗的开发。本研究采用牛痘病毒WR株，构建了表达PRRSV M蛋白的重组病毒rWR-PRRSV-M，为PRRSV重组活载体疫苗的研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株及实验材料 PRRSV CH-1a株、PRRSV阳性血清、PRRSV阴性血清和抗PRRSV M蛋白单克隆抗体(MAb)均由本所猪病研究室提供；重组转移质粒pSC11、BHK-21细胞和TK-143细胞均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 各种限制性内切酶、连接酶、反转录酶、Taq酶、Pyrobest酶、pMD18-T载体和DNA Marker均购自TaKaRa公司；质粒小量抽提试剂盒、胶回收小量试剂盒购自上海华舜公司；RNeasy®MiniKit、QIAquickPCR PurificationKit 购 自QIAGEN公司；LipofectamineTM2000 Reagent购自Invitrogen公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；FITC标记的兔抗猪IgG抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG抗体、HRP标记兔抗猪IgG抗体、5-溴-2-脱氧脲嘧啶(BrdU)购自SIGMA公司；胎牛血清购自GIBCOBRL公司。

1.3 实验动物 6周龄～8周龄BALB/c小鼠购自北京大学医学部实验动物实验中心。

1.4 PRRSV M基因扩增、克隆及鉴定 根据GenBank登录的PRRSV CH-1a株M基因(AY032626)设计引物 (表1)。用RNeasy®Mini Kit提取PRRSV CH-1a株总RNA，用随机引物进行逆转录反应后，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃5 min；94℃30 s、55℃ 45 s、72℃ 1 min，35个循环；72℃10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、胶回收后与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞JM109中。提取重组质粒，经PCR鉴定，由Invitrogen公司测序，鉴定正确的重组质粒命名为pMD-M。

1.5 PRRSV-M蛋白的截短原核表达、纯化及western blot鉴定 由于M蛋白在原核表达系统中难以表达，因此在设计引物M-JD-F、M-JD-R时将氨基端疏水性较强氨基酸残基去掉(表1)。以重组质粒pMD-M为模板，PCR扩增截短后的M基因，扩增产物经纯化、酶切、胶回收后与经同样处理的pGEX-6P-1载体连接，转化感受态细胞DH5α，经质粒提取，PCR、酶切鉴定正确后由Invitrogen公司测序，鉴定正确的重组质粒命名为pGEX-M。将pGEX-M转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG(终浓度为0.8 mM)诱导培养4 h～6 h，收集菌体进行超声破碎。包涵体用含0.6%十二烷基肌氨酸钠盐(SKL)缓冲液进行缓慢溶解后，加入终浓度为0.2%的PEG 4000与终浓度为1.0 mM氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽进行复性。利用GST纯化试剂盒进行纯化。将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE与western blot分析，以同样条件处理的空质粒pGEX-6P-1菌作为对照。

1.6 pSC11-PRRSV-M重组转移质粒的构建 以pMD-M为模板，通过引物SC11-M-F、SC11-M-R进行PCR扩增，反应条件为：95℃5 min；94℃30 s、60℃45 s、72℃1 min，35个循环；72℃10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、SalⅠ酶切、胶回收后与经同样处理的转移质粒pSC11连接，转化至感受态细胞JM109中。提取质粒，进行目的片段的连接方向鉴定，即使用引物P7.5-F和SC11-M-R进行PCR鉴定，反应条件为：95℃5 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR鉴定方向正确后由Invitrogen公司测序，鉴定正确的重组质粒命名为pSC11-PRRSV-M。

表1 PCR扩增引物设计Table 1 Primes designed for PCR

1.7 病毒重组 以含有终浓度为15 g/mL～25 g/mL的BrdU[20]的MEM培养液将TK-143细胞以0.5×105cells/孔～2×105cells/孔接种6孔细胞培养板。次日，待细胞生长程度达到80%时，将WR株痘病毒液(MOI=1)以10倍梯度稀释后接种于TK-143细胞，37℃感作1 h～2 h。按照LipofectamineTM2000说明书进行操作，将纯化的pSC11-PRRSV-M(2.0 μg)在脂质体的介导下转染感染病毒的单层TK-143细胞。将细胞于37℃培养并观察细胞病变(CPE)，待CPE达到80%时收毒。

1.8 重组病毒rWR-PRRSV-M的筛选 在终浓度为25 g/mL的BrdU的压力下，将感染转染后的培养物在TK-143细胞上盲传2代～3代，至细胞稍圆缩，但不形成蚀斑时，在Hela细胞上做蚀斑实验纯化重组病毒(X-gal染色)2代～3代至无可见的非重组病毒蚀斑(白色蚀斑)。即取盲传扩增的病毒液接种Hela单层细胞，37℃感作2 h后弃掉病毒液，加入含1%低熔点琼脂糖的DMEM营养琼脂，培养24 h～48 h，待出现典型的CPE时，再覆盖一层含250 μg/mL X-gal的DMEM营养琼脂，继续培养12 h～24 h后挑取蓝斑，进行新一轮的蚀斑纯化，共进行5轮蚀斑纯化。

1.9 rWR-PRRSV-M基因组中PRRSV M基因的PCR鉴定 将纯化的rWR-PRRSV-M感染TK-143细胞，培养后收取病毒液，采用常规的蛋白酶K裂解方法和酚/氯仿抽提方法提取总DNA，以其为模板进行PCR鉴定，反应条件为：95℃5 min；94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，35个循环；72℃10 min。

1.10 PRRSV M抗体水平的检测 以原核截短表达、纯化的PRRSV M蛋白为包被抗原，阳性对照的检测抗原为紫外灭活后的PRRSV全病毒。按常规方法建立间接ELISA法，通过方阵滴定试验来确定抗原包被浓度与血清稀释浓度，并在此基础上进一步确定酶标二抗的稀释度，以确定最佳工作浓度，建立ELISA方法，同时对试验结果进行统计学分析。

1.11 Western blot检测 将rWR-PRRSV-M以MOI约为1的量感染培养于6孔细胞培养板的BHK-21细胞，待CPE到90%时弃去培养液，按每孔50 μL体积加入1×SDS裂解缓冲液悬起细胞，煮沸10 min，取其上清进行SDS-PAGE电泳，将蛋白电转移到尼龙膜上，10%脱脂乳封闭过夜，PBST洗涤后加入1∶50稀释的猪阳性血清，室温作用2 h；PBST洗涤后加入 1∶5000倍稀释的 HRP-兔抗猪IgG，以DAB显色检测。用同样处理的WR株痘病毒感染的BHK-21作为对照。

1.12 rWR-PRRSV-M的间接免疫荧光检测(IFA)将rWR-PRRSV-M以MOI为0.01的感染量接种细胞，待出现明显病变时，弃去培养液，用PBS冼两次；用90%乙醇固定30 min，PBST洗涤，用含有1%BSA的PBS封闭2 h；PBST洗涤，加入一抗(PRRSV阳性血清)，37℃作用2 h；PBST洗涤，加入FITC标记的兔抗鼠的二抗，37℃作用2 h；PBST洗涤，于荧光显微镜下观察。

1.13 小鼠免疫及抗体水平的检测 rWR-PRRSV-M以MOI约为0.1的量腹腔免疫6周龄～8周龄的BALB/c小鼠，3周后对小鼠实施安乐死采血制备血清，并同时检测血清中的抗体水平。根据样品孔OD490nm测定值计算P/N值，大于2.1者判为阳性。

2 结果

2.1 PRR SV M基因的扩增与重组转移质粒pSC11-PRRSV-M的构建鉴定 应用RT-PCR方法从PRRSV CH-1a株感染的细胞总RNA中扩增出约为550 bp的DNA片段(图1)，与预期(546 bp)大小相符。将其插入pMD18-T载体中构建重组质粒pMD-M，并以其为模板，以引物SC11-M-F、SC11-M-R进行PCR扩增。将PCR产物克隆于转移质粒pSC11中，构建重组转移质粒pSC11-PRRSV-M。PCR扩增得到约为580 bp的特异性条带，证明PRRSV M基因插入方向正确(图2)。

图1 PRRSV M基因RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR amplification of PRRSV M gene

图2 重组转移质粒pSC11-PRRSV-M连接方向鉴定Fig.2 The orientation identification of the target gene in pSC11-PRRSV-M by PCR

2.2 原核表达重组质粒pGEX-PRRSV-M的诱导表达与免疫活性检测 将重组菌以终浓度为0.8 mM的IPTG进行诱导表达，菌体诱导培养物经超声波破碎后进行SDS-PAGE，结果获得了截短后的约为36 ku的PRRSV-M重组蛋白(图3)，western blot结果显示在36 ku处呈现反应条带，表达的目的蛋白具有较强的免疫原性(图4)。

2.3 rWR-PRRSV-M的筛选及基因组的PCR鉴定将pSC11-PRRSV-M转染于感染WR株痘病毒的TK-143细胞，pSC11-PRRSV-M与野毒WR株发生同源重组，重组牛痘病毒带有LacZ基因，在含X-gal的营养琼脂中产生蓝色蚀斑，而非重组病毒蚀斑无颜色反应(图略)；通过连续5轮蓝斑筛选、纯化后的病毒蚀斑均为蓝色。将纯化的rWR-PRRSV-M感染TK-143细胞后，收取病毒液提取病毒DNA进

图3 PRRSV M蛋白的SDS-PAGE结果Fig.3 Analysis of the recombinant PRRSV M by SDS-PAGE

图4 PRRSV-M蛋白的western blot结果Fig.4 Analysis of the recombinant protein PRRSV-M by western blot

图5 PCR鉴定rWR-PRRSV-M的M基因Fig.5 Identification of the M gene in rWR-PRRSV-M by PCR

2.4 rWR-PRRSV-M的western blot鉴定 感染rWR-PRRSV-M的BHK-21的CPE达到90%时，收集细胞进行裂解，将裂解的蛋白进行SDS-PAGE电泳后转印到尼龙膜上，western blot检测结果表明，rWR-PRRSV-M感染的细胞样品在约20 ku处出现一条反应条带，而野毒感染的细胞样品则无相应条带出现(图6)。这表明，rWR-PRRSV-M在感染的细胞内表达了PRRSV M蛋白，并且表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。

2.5 rWR-PRRSV-M的间接免疫荧光检测 将rWR-PRRSV-M以MOI为0.01的感染量接种BHK-21细胞，待出现明显病变时，进行IFA实验。结果表明，rWR-PRRSV-M在BHK-21细胞内表达了PRRSV M蛋白(图 7)。

2.6 rWR-PRRSV-M免疫小鼠血清的制备及ELISA检测 方阵滴定实验的结果表明，抗原包被浓度为0.5 g/mL，血清稀释度为1∶100时，ELISA结果的P/N值最高。将上述优化的条件对rWR-PRRSV-M免疫制备的血清，用原核截短表达的PRRSV M蛋白作为包被抗原作ELISA检测。结果表明，rWR-PRRSV-M免疫小鼠的抗体效价明显高于对照组(图 8)。

3 讨 论

本研究基于重组痘苗病毒不仅诱导机体产生体液免疫，而且诱导较强的细胞免疫的优点，构建了表达PRRSV M蛋白的重组牛痘病毒rWR-PRRSVM。小鼠免疫试验结果表明，rWR-PRRSV-M所表达的蛋白保持了良好的免疫原性及生物学活性。

在建立ELISA方法检测免疫后小鼠血清中的抗体时，考虑到用全病毒检测抗体的敏感性较低，本研究用截短表达的M蛋白作为检测抗原建立了ELISA方法，用全病毒与PRRSV的阳性血清作为阳性控制，这样使检测结果更加可靠，更有利于对M蛋白的抗原性进行探讨。经分析显示PRRSV M蛋白含有大量的疏水性氨基酸而使其完整蛋白很难表达，多次尝试均未成功。周艳君等研究表明，体外表达系统难以获得完整的M蛋白[20]。Kreutz等利用杆状病毒转移载体pVL1393将VR2332分离株的ORF6基因插入到多角体蛋白启动子下游，以很低的水平表达了M蛋白[21]。而Plana等利用杆状病毒表达系统表达西班牙Olot/91分离株的ORF6基因，却未获得成功[22]。因此，本研究采取截短后表达的措施，结果该蛋白以包涵体形式表达。本研究通过使用SKL缓冲液对蛋白进行了溶解、纯化和复性后获得了该蛋白，并且保持了很好的免疫原性。

本研究为PRRS重组活载体疫苗的研究提供了基础数据。一个外源蛋白在动物机体的免疫效果最终还是根据本体动物的免疫保护试验进行评价。我们将在进一步的工作中开展这方面的研究，并探讨rWR-PRRSV-M对本体动物的免疫保护效果，为研究预防PRRS的新型疫苗奠定基础。

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