HPLC 测定复方双花口服液中绿原酸的含量

余杰匡辽红林凡胜戴俊东孙毅坤

（1北京源生素源生物科技有限公司，北京 102212；2北京中医药大学中药学院，100102）

HPLC 测定复方双花口服液中绿原酸的含量

余杰1匡辽红1林凡胜1戴俊东2孙毅坤2

（1北京源生素源生物科技有限公司，北京 102212；2北京中医药大学中药学院，100102）

【摘要】目的：建立复方双花口服液中绿原酸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为迪玛C18（250×4.6 mm,5 μm）；流动相：0.4%磷酸－乙腈溶液（90∶10）；流速：1 mL/min，检测波长：327 nm；进样量：10 μL。结果：绿原酸在浓度 150.72～753.60 μg/mL范围内呈良好的线性关系（R2=0.999 6），平均回收率为98.87%(RSD=0.76%)。结论：本方法操作简便、准确、重复性好，精密度高，可作为复方双花口服液的质量控制方法。

【关键词】复方双花口服液；绿原酸；高效液相色谱法

1 仪器与试剂

岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪；SPD-10A检测器；chromato solutionlight色谱工作站。绿原酸对照品（由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号：110753－200212）；复方双花口服液（自制，批号为：070408、070409、070410）。甲醇、乙腈为色谱纯；磷酸为优级纯；实验用水为超纯水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：迪玛C18（250×4.6 mm,5 μm）；流动相：0.4%磷酸－乙腈溶液（90∶10）；流速：1 mL/min，检测波长：327 nm；进样量：10 μL。理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于2 000[2-3]。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品适量，置棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含150 μg的溶液（对照品储备液在10℃以下保存）。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取复方双花口服液样品1 mL，置10 mL具塞离心管中，加甲醇3 mL，摇匀，冰箱中放置过夜，过夜后的药液置2 000转/分条件下离心15分钟，上清液转移至10 mL容量瓶中。沉淀用2 mL甲醇洗涤，洗涤液置2 000转/分条件下离心5分钟。将两次离心得到的上清液收集至同一容量瓶中，甲醇定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过。滤液作为供试品溶液。

61例患者中最短DFI为0个月，最长为268个月，中位DFI为36个月。其中DFI≥36个月的31例，DFI<36个月的30例。肺部转移瘤中，乳腺癌的平均DFI最长为93个月，其次为软组织肉瘤92个月，肾癌平均DFI为57个月，结直肠平均DFI为30个月。1年、3年、5年的生存率分别为88.4%、35.8%、15.9%，平均生存时间为28.79个月，中位生存时间为25个月。死亡患者中有32例是因为出现多发远处转移，另有9例因其他疾病导致死亡。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方药中各药味比例，自配不含金银花的群药，按其工艺制成空白制剂，再按供试品溶液的制备方法制备空白溶液。

2.5 含量测定方法

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件分别进行测定，依外标法计算供试品溶液含量。对三批样品绿原酸的含量测定，每批样品取双份进行平行试验，取平均值，结果见表1。

表1 三批样品中绿原酸的含量测定结果

2.6 专属性试验

吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，依照含量测定方法进行测定，结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照液在此保留时间无色谱峰出现，即可视为无干扰。（色谱图见图1）。

2.7 线性关系的考察

精密称取绿原酸对照品18.84 mg，置25 mL容量瓶中，甲醇溶液定容。精密量取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于10 mL的容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：Y＝13 969X-59 417，R2＝0.999 6，绿原酸对照品浓度在150.72～753.60 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

图1 高效液相色谱图

2.8 精密度试验

精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样5次，依峰面积计算RSD为1.43%，表明仪器的精密度良好。

2.9 重复性试验

取同一批样品（批号070408）6份，按含量测定的方法进行测定，测得平均含量为1.104 0 mg/mL，相对标准偏差RSD为0.46%。

2.10 稳定性试验

取样品(批号070408)适量，按供试液制备方法制备供试液，分别于配制后0，2，4，6，8，12 h进样一次，每次10 μL，按上述色谱条件测定，记录峰面积。结果测得RSD= 1.85%。表明样品溶液在12 h内稳定。2.11 加样回收率

采用加样回收法，精密量取已知含量(1.076 3 mg/mL)同批样品1 mL，按低、中、高3个量级（0.753 4 mg/mL,1.054 9 mg/mL,1.205 8 mg/mL）精密加入绿原酸对照品甲醇溶液各1mL，同一量级平行操作3份，按含量测定中供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表2。

根据以上结果，表明本法具有良好的回收率。

3 结论

该制剂原含量控制方法采用的是薄层扫描法，实验中对两种方法的测定结果进行了比较，发现用HPLC方法测定的结果普遍优于薄层扫描的结果。阴性对照溶液在与对照品溶液、供试品溶液色谱相应的位置上无相同保留时间的色谱峰，表明对该方法无干扰；供试品色谱峰分离好，能够准确测定绿原酸的含量；精密度RSD为1.43%，重复性好，HPLC方法操作简便，可作为复方双花口服液的质量控制方法。

参考文献：

[1]中华人民共和国卫生部部标准[S].WS3-366（Z-52）-97（Z）.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京:化学工业出版社，2005：附录114-116.

[3]邹小娟,刘志辉,钱芳.清热养心颗粒的鉴别及其绿原酸含量测定[J].中国医药导刊，2008(59):908-910.

表2 回收率试验结果

孙毅坤，男，副教授。研究方向：中药分析与新药研究。通讯作者 E-mail：sunyik@163.com

作者简介：余杰，男，执业药师，主管药师。研究方向：中药制剂及质量管理。

Determination of Chlorogenic Acid in Fufang Shuanghua Oral Liquid by HPLC

YuJie1,Kuang Liaohong1,Lin Fansheng1,Dai Jundong2,Sun Yikun2(1 Beijing Yuansheng Suyuan Biolechnology Co.Ltd，Beijing 102212, China；2 Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

ABSTRACTObjective：To establish a method for determining the content of Chlorogenic Acid in Fufang Shuanghua Oral Liquid.Methods：HPLC with Dikma C18（250×4.6 mm，5 μm）column was used. 0.4%H3PO4-Acetonitrile（90∶10）as the mobile phase,flow rate was 1.0 mL/min and detection wavelength at 327 nm.Results：There was a good linear relationship at a range of 150.72-753.60 μg/mL for Chlorogenic Acid (R2=0.999 6).The average recovery rate was 98.87%with RSD of 0.76%.Conclusion：The method is simple，fast and accurate.It can be used for quality control of Fufang Shuanghua O-ral Liquid.

KEY WORDSFufang Shuanghua Oral Liquid;Chlorogenic Acid; HPLC