添加红景天苷的全价粮对犬血液生化指标和肝转录组学的影响

摘 要： 旨在研究全价粮添加红景天苷对犬血液和肝转录组学的影响，以期为犬的肝养护及肝疾病预防工作提供试验数据支持。选取10只成年中华田园犬（平均体重 8.67±1.00 kg），随机分为对照组（n=5）和试验组（n=5），分别饲喂对照犬粮和红景天苷全价粮。通过血液检查来评估红景天苷全价粮的饲喂效果和安全性，并通过转录组学技术探究红景天苷全价粮对犬潜在的调节机制，试验期为8周。血液检查结果显示，红景天苷全价粮显著降低了犬血清谷丙转氨酶的浓度（Plt;0.05），对其他大部分指标没有显著影响（Pgt;0.05），但相比于对照犬粮，采食红景天苷全价粮的犬血液指标波动小，能保持血液指标的稳定。转录组学分析结果显示，差异表达基因显著富集在钙信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路等。针对表型的基因集富集分析结果表明，红景天苷全价粮在脂代谢、糖代谢、炎症、氧化应激和纤维化方面起调节作用，其中对于糖脂代谢的调节更显著，相关信号通路在试验组显著上调。综上所述，红景天苷全价粮具有降低犬血清谷丙转氨酶浓度的作用，能够稳定犬的血液指标浓度，调节了犬的肝糖脂代谢，这可能主要通过调节钙信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路来实现。

关键词： 红景天苷；转录组学；糖脂代谢；犬

中图分类号：S858.292"""" 文献标志码：A"""" 文章编号： 0366-6964（2025）01-0455-11

收稿日期：2024-01-02

基金项目：湖北省自然科学基金（2022CFB327）；华中农业大学-中国农业科学院深圳农业基因组研究所合作基金（SZYJY2022008）；“十四五”国家重点研发计划项目（2023YFD1301000）

作者简介：王盛琪（1999-），女，黑龙江佳木斯人，硕士，主要从事宠物营养研究，E-mail： KKY@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：齐智利，主要从事宠物营养研究，E-mail： zhiliqi@mail.hzau.edu.cn；张 鑫，主要从事基因工程动物和动物疾病模型的研发及应用，E-mail：zhangxin@gmu.edu.cn

Effects of Salidroside-added Complete Nutrition Food on Blood Biochemical Indexes and

Liver Transcriptomics in Dogs

WANG" Shengqi E-mail： zhiliqi@mail.hzau.edu.cn；ZHANG Xin，E-mail： zhangxin@gmu.edu.cn

肝是动物机体重要的代谢器官，承担着许多生理功能，包括合成、贮存、分解、排泄、解毒和分泌等^［1］。在临床病例中，犬类的肝疾病非常常见，3%的犬病都与肝疾病有关，对犬机体的危害十分严重，是夺走犬类生命的五大疾病之一^［2］。因此，维护犬肝健康、预防肝疾病发生对于犬的整体健康至关重要。

目前，已有一些具有保肝特性的营养物质被用于宠物食品中作为保护宠物肝功能的营养管理^［3］。红景天苷（Salidroside）是一种从红景天（Rhodiola rosea）中提取的天然产物，具有抗疲劳、抗氧化、免疫调节、清除自由基等多种药理活性。已有研究表明，红景天苷在改善肝功能方面具有潜在的益处，它能抑制氧化应激和炎症因子的释放，从而对肝发挥"" 保护作用，在改善如非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等肝疾病中有很大的应用潜力^［4-5］。然而，虽然有一些关于红景天苷对人类肝健康的研究，但对于应用在犬的饮食中的研究很少。

红景天苷全价粮的营养成分经过合理调配，并添加具有护肝作用的红景天苷，被设计用于维护和促进犬的肝健康。在过去的几十年里，分子生物学、基因组学和生物信息学的快速发展，使人们能够更全面地理解生物体内的基因表达和代谢途径。肝作为一个高度复杂的器官，其功能受到众多基因和代谢途径的调控，因此，通过肝脏转录组学的研究，可以深入探讨这一全价粮对犬肝健康的影响机制。本文将通过试验研究，评估添加红景天苷的全价粮对犬血液和肝转录组学的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取10只成年中华田园犬，体重（8.67±1.00）kg，随机分为对照组和试验组，每组包括5只犬。这两组分别被饲喂对照犬粮和红景天苷全价粮（红景天苷含量为5g·kg^-1）。试验前，所有犬只在适应性饲养期内进行了1周的环境适应，正式试验期8周。试验期内保持正常饲养环境，温湿度平衡，所有犬只自由饮水。

1.2 试验仪器与材料

全自动五分类动物血液分析仪（ProCyte Dx， IDEXX， Sysmex Corporation， Kobe， Japan），动物专用全自动生化分析仪（Catalyst One， IDEXX， Westbrook， ME， USA），

对照组犬粮为市售全价配合犬粮，其营养成分范围为：水分≤10.0%、粗蛋白≥18.0%、粗脂肪≥5.0%、粗纤维≤9.0%、粗灰分≤10.0%、钙≥0.6%、总磷≥0.8%、赖氨酸≥0.63%、水溶性氯化物（以Cl-计）≥0.09%。红景天苷全价粮由赣州大健康宠物科学研究院、赣南创新与转化医学研究院和江西惠宠科技有限公司联合研发。

1.3 犬红景天苷全价粮营养标准

红景天苷全价粮营养标准符合国家标准《GB／T 31216—2014全价宠物食品——犬粮》和美国饲料管理协会（AAFCO）的要求。所选用的原料和添加剂符合《饲料原料目录》和《饲料添加剂目录》的规定。红景天苷全价粮基础营养成分检测值如表1所示。

1.4 样品采集

1.4.1 血液样品采集

在试验的第0周和第8周，通过犬前肢头静脉采血，每只犬每次采血2.5 mL。其中，0.5 mL置于EDTA抗凝管内，用于血常规检测；2 mL血液存放于肝素锂抗凝管中，离心后取上清液用于血生化检测。

1.4.2 肝组织样品采集

在试验的第8周，使用超声引导进行肝穿刺活检，每只试验犬穿刺7针，以获得肝组织样本，于-80℃中保存，用于转录组测序。

1.5 指标测定

1.5.1 试验前基础生理指标检测

在进行试验前，对所有试验犬进行基础生理指标检测，包括体重（kg）、鼻肛体长（cm）、腰围（cm）、臀围（cm）、背部皮下脂肪厚度（mm）以及体况评分（Body Condition Scoring，BCS）。

1.5.2 血液指标测定

采集的血液样本送至惠康动物检测（武汉）有限公司医学检验实验室进行血常规和血生化检测分析，血常规测定指标包括白细胞计数（WBC）、淋巴细胞比例（LYM/%）、单核细胞比例（MON%）、中性粒细胞比例（NEU/%）、嗜酸性粒细胞比例（EOS/%）、嗜碱性粒细胞比例（BAS/%）、红细胞计数（RBC）和血小板计数（PLT）。血生化测定指标包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、肌酸激酶（CK）和淀粉酶（AMY）。

1.5.3 肝组织转录组学分析

1.5.3.1 总RNA提取和反转录：

使用TRIzol法提取犬肝组织RNA，然后按照逆转录试剂盒（HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper），Vazyme，Nanjing，China）说明书操作合成cDNA。

1.5.3.2 数据分析：

首先，采用 FastQC v0.12.1对原始数据进行质控，以获得高质量的clean reads。然后，使用HISAT2 2.2.1将获得的 clean reads 比对到参考基因组，并通过SAMtools 1.19.2进行排序和去重。最后采用R语言包DESeq2（R4.1.2）进行差异表达基因分析，筛选差异表达基因（differentially expressed genes， DEGs）时使用padjlt;0.05 amp; log2foldchange＞log2（1.5）作为阈值。

1.5.3.3 DEGs功能注释及富集分析：

首先，基于筛选出的DEGs，通过基因组注释文件获得了DEGs的蛋白序列及相关注释信息。然后，使用homologene包进行物种转换，将犬的注释转换为人的注释，并采用KEGGannotation将获得的DEGs的蛋白序列比对到人类蛋白数据库，以获得与 DEGS的ENTREZID。最后使用R语言包ClusterProfiler v.4.4.4进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes， KEGG）富集分析和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。GSEA分析需要计算基因集的ES（enrichment score）值，其反应基因集成员s在排序列表L的两端富集的程度。计算方式是，从基因集L的第一个基因开始，计算一个累计统计值。当遇到一个落在s里面的基因，则增加统计值。遇到一个不在s里面的基因，则降低统计值。对ES值进行显著性评估，基于基因集做排列检验，计算P值，随后根据基因集的大小对ES进行标准化，再计算假阳性率，即为校正后的P值。

1.6 数据统计与分析

使用EXCEL 2019软件对试验数据进行初步整理，并使用SPSS 23.0软件对数据进行独立样本T检验和Mann-Whitney U检验。结果以“平均值±标准差”形式表示，Plt;0.05表示差异显著，Plt;0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 试验前犬基础生理指标检测结果

试验前犬基础生理指标检测结果如表 两组犬的体重、鼻肛体长、腰围、臀围、背部皮下脂肪厚度和BCS评分均处于相似水平，组间无显著差异。

2.2 红景天苷全价粮对犬血液指标的影响

2.2.1 红景天苷全价粮对犬血液常规检查指标的影响

血常规指标检测结果如表3所示，结果显示，两组LYM的血液浓度在试验前存在显著差异，经过饮食干预后，差异消失。试验前，两组犬血中PLT浓度存在极显著差异，试验后组间差异消失，但对照组的PLT在第0周和第8周间存在显著差异，试验组的PLT血液浓度在试验前后不存在显著差异，且差异微小。这说明红景天苷全价粮比对照犬粮更能维持血中PLT浓度稳定。其他血常规指标在两组间不存在显著性差异，说明红景天苷全价粮不会对血常规指标产生较大影响，而使其保持更稳定的状态，有利于犬的健康。

2.2.2 红景天苷全价粮对犬血清生化指标的影响

犬第0周和第8周的血生化指标检测结果如表4所示。试验期间，试验组的ALT血清浓度显著降低（Plt;0.05），且与对照组间无显著性差异（Pgt;0.05）。这说明红景天苷全价粮能够降低血清中ALT浓度，并与其他正常犬保持相对稳定。试验期间对照组TG血清浓度显著下降（Plt;0.05），试验组保持稳定，未发生显著变化（Pgt;0.05）。两组间的CK血清浓度在第0周时存在显著差异（Plt;0.05），第8周时，对照组的CK显著下降（Plt;0.05），但试验组的CK血清浓度保持相对稳定，未产生显著性变化（Pgt;0.05），同时，对照组的AMY显著高于试验组（Plt;0.05），结合对照组第0周时及试验组试验前后AMY浓度变化，说明红景天苷全价粮在稳定血生化指标上起到重要作用。其他血生化指标在两组间不存在显著性差异（Pgt;0.05），说明红景天苷全价粮不会对犬血生化指标产生较大影响，这也可以说明红景天苷全价粮具有较高的安全性。

2.3 红景天苷全价粮对犬肝组织转录组学的影响

2.3.1 层次聚类分析结果

如图1所示，两组样品分别被聚类到两簇，说明组内样品相似度较高，试验设置的饮食条件是影响聚类的主要因素。

2.3.2 KEGG通路富集分析结果

如图2所示，KEGG通路富集分析结果显示前3条显著富集的信号通路为钙信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路，每条通路上均有30个以上差异基因富集。前10条内其他显著富集的通路为cAMP信号通路、PPAR信号通路、胰岛素信号通路、胰高血糖素信号通路、cGMP-PKG信号通路、催产素信号通路和Apelin信号通路。

2.3.3 基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis， GSEA）

2.3.3.1 表型相关通路富集分析结果：

如图3所示，在5种表型中显著富集的通路共有26条。其中，与脂代谢相关的通路有长链脂肪酸运输、脂肪酸β氧化、中性脂质分解代谢过程、脂质氧化、脂肪酸 分解代谢过程、甘油酯分解代谢过程、中性脂质代谢过程、脂质修饰、磷脂代谢过程的调节、脂肪细胞分化的正向调节、肌肉细胞命运定型和短链脂肪酸代谢过程；与糖代谢相关的通路有丙酮酸乙酰辅酶的生物合成过程、丙酮酸代谢过程、6 磷酸果糖代谢过程、核苷酸糖生物合成过程和磷酸肌醇介导的信号传导；与炎症相关的通路有细胞膜钙离子运输、p38MAPK 级联和调节细胞膜钙离子浓度；与纤维化相关的通路有细胞外基质组织的正向调节和超分子纤维组织；与氧化应激相关的通路有氧化磷酸化、线粒体电子传递细胞色素 c 到氧气、活性氧生物合成过程的正向调节和对氧水平的反应。

2.3.3.2 表型相关基因富集分析结果：

如图4所示，在脂代谢相关显著富集的基因中，FABP4、APOA4、FABP3、FABP1、ADIPOQ等29个基因在试验组显著上调，在对照组中显著下调。在糖代谢相关显著富集的基因中，FBP2、ALDOA、HK2、ENO3、ME3等30个基因在试验组显著上调，在对照组中显著下调。在氧化应激相关显著富集的基因中，CAV3、ACTN3、CRYAB、HK2、LIMD1等27个基因在试验组显著上调，在对照组中显著下调。在纤维化相关显著富集的基因中，CASQ1、LMOD2、CLIP4、PFN2、LOX等22个基因在试验组显著上调，在对照组中显著下调。在炎症相关显著富集的基因中，CACNA2D1、GADD45G、ANK2、GADD45A、P2RY1等18个基因在试验组显著上调，在对照组中显著下调。

2.3.3.3 表型相关富集通路上、下调情况：

如图5所示，5种表型相关富集通路在试验组显著上调。脂代谢相关通路中长链脂肪酸运输、脂肪酸β氧化、中性脂质分解代谢过程、脂质氧化、脂肪酸分解代谢过程和短链脂肪酸代谢过程信号通路的ES评分完全小于0。糖代谢相关通路中丙酮酸乙酰辅酶的生物合成过程和6 磷酸果糖代谢过程信号通路的ES评分完全小于0。纤维化相关通路中细胞外基质组织的正向调节信号通路的ES评分完全小于0。氧化应激相关通路中氧化磷酸化、线粒体电子传递细胞色素 c 到氧气和活性氧生物合成过程的正向调节信号通路的ES评分完全小于0。

3 讨 论

近年来，功能性宠物食品备受人们的关注和认可。这些食品在提供犬猫必需营养素的基础上，还包含了一些功能性营养物质，能够为宠物提供额外的健康益处。然而，这些功能性营养物质大多是从人类的功能性食品中发现，而后应用到宠物食品中的，犬猫本身的试验研究很少^［6］。

本研究使用的红景天苷全价粮含有的犬易消化的优质蛋白减少肝负担，低铜含量减少铜在肝内蓄积，从而减少肝细胞的潜在损伤。肝铜蓄积可由铜摄取增加、肝铜代谢原发性缺陷或胆道铜排泄改变引起^［7］。研究表明，肝中过量的铜积累是犬肝炎和肝硬化的原因之一，这一点最先在贝灵顿梗身上得到证实，随后，肝的铜积累也在其他犬种中被发现^［8］。此外，红景天苷作为功能性成分的添加可能促进了全价粮在调节糖脂代谢和炎症反应方面发挥作用。因此，红景天苷全价粮结合营养成分的科学制备和功能性物质的添加，以期在维持犬肝健康方面发挥重要作用。

试验前犬基础生理指标检测结果显示，两组间没有显著差异，说明试验犬在试验前的健康状态相似，为后续的研究提供了一个健康的基线。两组间血常规检测结果中存在显著差异的指标为LYM和PLT，然而，需要注意的是，在试验前，对照组犬这两种指标浓度较高或较低，在试验后与试验组水平一致，而试验组在试验前后没有显著变化。这说明红景天苷全价粮有助于维持犬血常规指标相对稳定。血清生化检查是评估肝损伤程度的常见方法，其中转氨酶的血清浓度被认为典型的肝损伤生物标志物^［9］。ALT受其他组织的细胞损伤影响很小，对肝细胞损伤具有很高的特异性和灵敏性，血清浓度越高代表肝损伤程度越高^［10］。本试验中，试验组犬血清中ALT浓度显著下降，这表明红景天苷全价粮有助于降低肝损伤的风险。这可能与红景天苷的加入有关，研究表明，ALT的血清浓度在一定程度上可以反映肝脂质积累程度^［11-12］，红景天苷可以有效降低大鼠血清肝酶浓度，调节有关糖脂代谢相关通路中的PI3K等基因的表达^［13］。

通过对犬肝组织进行转录组学分析，发现显著富集的通路主要为钙信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路。钙信号通路在各种生物过程中都至关重要，而肝细胞内的信号传导非常复杂^［14］。关于镉在大鼠肝细胞中通过 Ca²⁺ 信号传导诱导细胞毒性的分子机制的研究中发现，镉主要通过刺激细胞内贮存Ca²⁺的细胞器释放Ca²⁺和抑制细胞间隙连接通讯（GJIC）来引发细胞内游离 Ca²⁺ 浓度升高，从而造成细胞毒性损伤，而红景天苷可用于防止镉诱导的细胞毒性^［15］。PI3K-Akt途径在代谢、大分子合成和细胞生长、存活、增殖、凋亡等生物过程中发挥重要作用，近年有研究表明其在肝的糖脂代谢过程中也起重要作用^［16］。研究表明，激活PI3K/Akt信号通路能够抑制下游相关基因的表达，缓解肝的炎症反应，抑制肝脂肪变性和积累，缓解肝损伤^［17-18］。红景天苷可以通过靶向 PI3K/AKT/Gsk3-β通路，抑制脂质积累和肝细胞凋亡，促进肝细胞增殖并缓解肝脂肪变性、氧化应激和炎症反应^［19］。MAPK信号通路通常与肝的炎症和纤维化的发生有关^［20-21］ 。在肝健康的营养调控中，红景天苷能够通过抑制包括MAPK在内的多条信号通路，抑制NLRP3炎症小体激活，从而缓解肝炎症^［22］。随后，本研究对不同表型的基因集进行了富集分析。结果表明，显著富集通路数量由高到低排列的表型为脂代谢、糖代谢、氧化应激、炎症和纤维化。结合不同通路上的基因富集情况，可以看出红景天苷全价粮在调节糖脂代谢方面起到了重要作用。

脂质代谢失调导致的肝细胞脂质积累会产生毒性作用，也称为脂毒性，会导致具有不同表型和严重程度的肝疾病，包括轻度脂肪变性、脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌^［23］。在本次试验中，脂代谢相关通路主要涉及脂肪酸的运输及氧化分解代谢，这个过程涉及大量的蛋白质参与。以大鼠为例，研究已经证明肝细胞质膜中的蛋白质在介导脂肪酸转运方面具有功能性证据，这些研究结果导致了脂肪结合蛋白质（FABPpm）的鉴定^［24-26］。脂肪酰基辅酶A分子的生成通过硫酯化活化CoA来实现，这是长链脂肪酸代谢所必需的步骤，该反应由长链酰基辅酶A合成酶（ACSL）家族成员催化^［27］。另外，ACC2（ACACB）生成的丙二酰辅酶A通过抑制肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）在β氧化中起到关键作用，这是脂肪酸代谢中的一个负调节步骤^［28］。CPT1作为脂肪酸氧化过程中的关键酶，通过饮食调节在肝中表达量上调，从而调节脂质代谢^［29-30］。这些脂代谢相关基因在试验组均呈现显著上调，是两组间差异显著性较高的部分基因，可能在红景天苷全价粮对于犬脂代谢调节过程中起到重要作用。

糖代谢与脂质代谢密切相关。通常情况下，胰岛素抵抗伴随着肝脂肪变性，当发生胰岛素抵抗时，高胰岛素血症的作用会抑制脂肪分解，促进脂质合成，同时导致异位脂质的积累，增加了葡萄糖向肝的转运，从而促进脂质合成，最终导致高脂血症^［31］。糖脂代谢紊乱通常可以通过饮食进行调节。研究表明，黄芩和黄连的复合物能够通过调节MAPK/PI3K/Akt信号通路改善II型糖尿病（T2DM）大鼠的葡萄糖和脂质代谢^［32］；还有研究指出，富含多酚的枇杷果实提取物能够通过调节小鼠的糖脂代谢、氧化应激和炎症等过程来预防果糖诱导的非酒精性脂肪肝病^［33］。此外，全价粮中添加的红景天苷也有相关的研究。膳食补充红景天苷能够通过AMPK/PI3K/Akt/GSK3β通路显著降低脂肪肝出血性综合征蛋鸡和糖尿病小鼠的血糖和血清胰岛素水平，缓解胰岛素抵抗，并改善血脂水平和肝脂肪变性^{［19，34］}。

4 结 论

本研究中，饲喂红景天苷全价粮的犬只血液大部分指标均保持稳定且没有显著性变化，这表明红景天苷全价粮具有良好的安全性。本研究使用的红景天苷全价粮对犬的健康产生积极影响，表现为稳定犬血液指标浓度，具有较高安全性，能够调节犬肝糖脂代谢，这可能与钙信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路有关。这些发现为开发更健康的犬食品或改善犬的肝健康提供了重要的科学依据。未来可以对这些存在显著差异的信号通路及基因进行体内或体外试验，进一步验证其在犬肝保护过程中起到的关键性作用。

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（编辑 范子娟）