表儿茶素没食子酸酯对MAC-T和小鼠乳腺炎症与细胞焦亡及NF-κB通路和NLRP3炎性小体的抑制效应

摘 要： 本研究旨在探究表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate， ECG）对牛乳腺上皮细胞NF-κB（nuclear factor kappa B）炎性通路和NOD样受体3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎症小体的抑制作用。利用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）处理牛乳腺上皮细胞系（MAC-T）和小鼠乳腺；采用CCK-8法筛选ECG处理MAC-T细胞的最佳浓度，ELISA法检测促炎因子、氧化应激指示因子以及焦亡指示因子的表达水平；苏木精-伊红染色和Annexin V-FITC/PI法检测小鼠乳腺组织炎性变化和细胞膜破裂情况；Western blot检测NF-κB、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein， ASC）、caspase-1和Gasdermin NH 3 端（GSDMD-N）的表达水平；免疫荧光检测p65核转移情况。结果发现：1）ECG在10、20、40 mg·kg^-1浓度下均可减轻LPS诱导的乳腺炎症和炎性细胞浸润；2）ECG在体内和体外均可显著且剂量依赖性地降低LPS诱导的促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和氧化应激指示因子（COX-2、iNOS、MPO）表达水平（Plt;0.05）；3）ECG剂量依赖性地降低了LPS诱导的细胞死亡率以及ROS、IL-18和LDH焦亡指示因子表达水平（Plt;0.05）；4）ECG极显著地抑制LPS诱导的NLRP3、ASC、GSDMD-N、caspase-1、磷酸化p65的表达与核转移（Plt;0.05）。综上表明，ECG抑制MAC-T细胞和小鼠乳腺炎症与细胞焦亡以及NF-κB通路和NLRP3炎性小体。本研究为利用ECG替代抗生素防治牛乳腺炎提供了新的数据。

关键词： 表儿茶素没食子酸酯；NF-κB；乳腺炎；NLRP3炎性小体；焦亡

中图分类号： S857.26"""" 文献标志码：A"""" 文章编号： 0366-6964（2025）01-0430-12

收稿日期：2024-01-24

基金项目：国家自然科学基金（32171673）

作者简介：王浩磊（1999-），男，上海人，硕士生，主要从事动物营养与动物炎症治疗研究，E-mail： yipianche@qq.com；刘梦燕（1998-），女，山西汾阳人，硕士生，主要从事动物分子遗传育种研究，E-mail： 798163059@qq.com。王浩磊和刘梦燕为同等贡献作者

*通信作者：蒋曹德，主要从事动植物分子遗传育种与饲料生物技术与加工利用研究，E-mail： jcdpjx@swu.edu.cn；林 涛，主要从事动物营养与动物炎症治疗研究，E-mail： 727826660@qq.com

Inhibition of Epicatechin Gallate on Inflammation and Pyroptosis as Well as NF-κB

Pathway and NLRP3 Inflammasome in MAC-T Cells and Mouse Mammary Glands

WANG" Haolei LIU" Mengyan LONG" Quan LI" Manman L Xiang LIN" Tao 为制约奶牛健康和乳品产业发展的关键因素^［1］。乳腺炎主要由微生物感染引起，但是环境因素、人为因素以及牛自身的遗传因素等也是其诱因^［1］。引起乳腺炎的主要的病原菌包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和链球菌（Streptococcus）等，其中大肠杆菌是导致急性临床乳腺炎最常见的病原菌，它的细胞外膜主要致病成分脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）通过激活核因子κB（nuclear factor kappa B， NF-κB）信号通路和NOD样受体3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎性小体诱发乳腺组织炎性反应和焦亡^［2］。因此，LPS被广泛应用于多种动物的炎症模型的建立^［3-5］。

焦亡为依赖于caspase-1和促炎调节的细胞程序性坏死，又称细胞炎性死亡^［6］。在LPS诱导的焦亡信号通路中，LPS被Toll样受体4（TLR4）二聚体识别，导致NF-κB的活化与NLRP3（NOD-like receptor protein 3）炎性小体的组装^［2］，进而通过caspase-1、Gasdermin NH 3端 （GSDMD-N）的作用形成细胞膜穿孔，释放乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase， LDH）和IL-1β、IL-18等促炎细胞因子促进炎性疾病的发生^［7-9］。因此，NF-κB和NLRP3炎症小体在LPS诱导的炎性反应和细胞焦亡中起关键作用。

表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate， ECG）是一种重要的类黄酮物质，广泛存在于茶、葡萄、可可和红酒中^［10-11］。众多研究已证实ECG在抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗凋亡等方面具有显著作用^［12-16］，因此它被用于龋齿、牙周病和动脉粥样硬化的治疗研究^［17-18］。在作用机制方面，研究发现ECG通过阻断p65的磷酸化来抑制NF-κB的激活，减少NLRP3炎症小体的形成和IL-1β与TNF-α的释放，从而缓解小鼠在缺氧环境下的神经炎症^［13］。同时，ECG抑制丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路，减轻炎症和细胞凋亡^［14］。最近的研究也表明，ECG抑制NF-κB和MAPK的磷酸化，防止小鼠动脉粥样硬化的恶化^［18-19］。然而，目前关于ECG的报道大多局限于小鼠和大鼠模型的抗炎和抗凋亡特性，ECG在乳腺炎性反应和焦亡方面的作用有待阐明。

本研究通过LPS刺激MAC-T细胞和小鼠乳腺，探讨了ECG对乳腺炎症与焦亡的抑制作用及其分子机制，为利用ECG替代抗生素防治乳腺炎奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和处理

DMEM培养基（Gibco，苏州）中加入100 U·mL^-1青霉素、10%胎牛血清和100 μg·mL^-1链霉素（Solarbio，北京）。根据需要选择96孔板或者6孔板，将MAC-T细胞（BNCC，河北廊坊）接种于上述培养基，并在37℃、5% CO 2（Forma Series 3 WJ，Thermo）的培养箱中培养至对数生长期。采用1 μg·mL^-1 LPS^［3-4］和1、15或30 μg·mL^-1 ECG处理MAC-T细胞（ECG的处理浓度根据下述细胞活性检测确定），并继续培养24 h。每个处理重复5次，用LPS单独处理的细胞和LPS+20 μg·mL^-1 地塞米松（dexamethasone，DEX，一种广泛用于治疗炎症性疾病的类固醇药物）处理的细胞分别作为ECG处理阴性和阳性对照。

1.2 细胞活性检测（CCK8）

将重悬的MAC-T细胞接种到96孔板中，每孔100 μL的细胞悬液。待细胞长到90%（2×106细胞·孔^-1），将配制好的ECG原液用不含FBS的DMEM培养基稀释至0、1、3、6、15、30、60、90、120和200 μg·mL^-1处理细胞，并在处理孔周围加入100 μL PBS 缓冲液，每个处理5个重复。处理24 h后在每孔加入10 μL CCK-8溶液（Solarbio，北京），培养箱孵育2 h后用酶标仪测定450 nm处的光密度值（OD）。

1.3 动物体内试验

从恩彼生物技术有限公司（重庆）购买6～8周龄的BALB/c小鼠（18只，♀36只），母鼠每笼2只，公鼠每笼1只，自由采食，在光照/黑暗各12 h的条件下饲养7 d。随机选取2只母鼠和1只公鼠共同饲养在一个笼子里，进行配种。产后7 d，将成活并泌乳的30只母鼠随机分为6组，每组5只：空白对照组、LPS组（10 μg·kg^-1）、LPS+ECG（10、20和40 mg·kg^-1）组^［20］，以及LPS+DEX（0.5 mg·kg^-1）组，其中LPS组、LPS+DEX组分别作为ECG处理阴性和阳性对照。注射前将母鼠和子鼠分离2 h后，LPS+DEX和LPS+ECG组进行腹腔注射，空白组和 LPS 组腹腔注射等量生理盐水。按照前期的方法^［4］，1 h后用2%戊巴比妥钠（50 mg·kg^-1）麻醉小鼠，将LPS注射到雌鼠的第四对乳头的乳腺导管中。24 h后当乳腺出现红肿充血时眼球采血5 mL，注入含有0.1 mL肝素钠（10 mg·mL^-1 盐水溶液）的10 mL离心管中，4 ℃，3 000×g离心30 min，收集血清。颈部脱臼法处死小鼠，取出乳房组织，其中一部分置于4%多聚甲醛固定液中，另一部分储存于-80℃备用。

1.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

细胞在6孔板中培养并按“1.1”方法处理，小鼠按“1.3”方法处理。根据 ELISA试剂盒说明书（博诺恒生物科技有限公司，重庆）测定细胞上清和小鼠血清中炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和氧化应激指示因子（COX-2、iNOS）的含量。

1.5 Western blot

将“1.1”和“1.3”中处理过的细胞和小鼠组织研磨，使用细胞总蛋白提取试剂盒（Solarbio，北京）提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒（Solarbio，北京）进行定量。Western blot按照Ma等^［3］的方法，每个试验3次重复。所用的一抗包括p65（bs-23217R）、p-p65（bs-0982R）、IκB（bs-1287R0）、p-IκB（bs-2513R）、NLRP3（19771-1-AP）、caspase-1（22915-1-AP）、ASC（10500-1-AP）、GSDMD-N（20770-1-AP）、β-actin（bsm-33036M）（Proteintech，湖北武汉），一抗稀释比例均为1∶1 000；二抗为 Goat Anti-rabbit IgG/HRP（BS13278；Bioss，北京），稀释比1∶5 000。胶条使用化学发光ECL-Western blot检测试剂（Bioground，重庆）进行可视化，并使用Image Lab（版本5.2. Bio-Rad）进行定量。

1.6 免疫荧光

细胞和小鼠处理如“1.1”和“1.3”，按照前期的方法进行GSDMD、NLRP3和p65核转移免疫荧光检测^［3-4］。简而言之，处理过的MAC-T细胞相继用乙醇孵育10 min，2%的Triton X-100（Beyotime， 重庆）孵育5 min，5%的BSA Block Buffer（Beyotime， 重庆）孵育1 h；分别利用GSDMD、NLRP3以及磷酸化p65（p-p65）的抗体孵育，再用兔抗山羊IgG/Cy3抗体（Bioss， 北京）孵育；使用DAPI对核进行染色，在荧光倒置显微镜（Leica， Wetzlar， GER）下观察。

1.7 Annexin V-FITC/PI分析

将“1.1”处理的MAC-T细胞接种于24孔板，待其生长到90%时，用PBS洗涤3次。按照Annexin V-FITC/PI检测试剂盒（翌圣生物科技，上海）说明书在每个培养孔加入10 μL Annexin V-FITC和20 μL PI Staining Solution，避光、室温反应10～15 min。再加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，1 h内利用荧光倒置显微镜（Leica， Wetzlar， GER）进行拍照，并使用Image Lab（版本5.2. Bio-Rad）进行定量。

1.8 苏木精-伊红（HE）染色

HE染色由武汉赛维尔生物科技有限公司完成，即将“1.3”方法处理的小鼠R4乳腺组织固定在4%（体积比）的甲醛中，经过脱水、透明化、蜡浸和石蜡包埋后切成5 μm厚的切片。切片进行二甲苯脱蜡（共3缸，5 min·缸^-1）；过无水、90%、80%、70%的乙醇（各1缸，均3 min·缸^-1），蒸馏水再清洗3 min；依次进行苏木精染色10 min、伊红染色5 min，经80%、90%和无水乙醇脱水及二甲苯透明化处理后，在生物显微镜（Leica， Wetzlar， GER）下观察组织损伤。

1.9 髓过氧化物酶、活性氧和乳酸脱氢酶检测

收集“1.1”方法处理的细胞上清和“1.4”方法处理的小鼠血清，按照MPO、ROS检测试剂盒和LDH活性检测试剂盒（Solarbio， 北京）说明书，使用Multiskan GO（Thermo， 美国）分别于460、525和450 nm波长处测定MPO（myeloperoxidase）和LDH活性以及ROS（reactive oxygen species）的含量，每次检测重复3次。

1.10 统计分析

使用SPSS26.0软件进行单因素方差分析，并进行Duncan多重比较。统计显著性设定为Plt;0.05 或 Plt;0.01。

2 结 果

2.1 ECG在MAC-T细胞与小鼠乳腺中的抗炎作用

首先，利用不同浓度的ECG处理MAC-T细胞筛选最佳的处理浓度。CCK-8检测表明，ECG在1、3、6、15和30 μg·mL^-1浓度下对MAC-T细胞活性无影响；当ECG浓度在60 μg·mL^-1以上时显著降低了细胞活性（Plt;0.0 图1A）。因此，在后续研究中采用的ECG浓度梯度为1、15和30 μg·mL^-1。进一步采用ELISA检测不同浓度ECG处理下MAC-T细胞促炎细胞因子和氧化应激细胞因子的表达变化（图1B～G）。与对照组相比，受LPS诱导的MAC-T细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的蛋白水平以及MPO活性极显著增加（Plt;0.01）；但是，ECG处理后上述细胞因子的表达和MPO活性呈剂量依赖性且极显著降低（Plt;0.01），其中30 μg·mL^-1 ECG处理组的MPO活性极显著低于DEX处理组（Plt;0.01）。

其次，为了证实ECG体外抗炎效果，分析了ECG对小鼠乳腺炎症的抑制作用。图2A显示，对照组小鼠乳腺组织正常，LPS组小鼠乳腺组织肿胀、充血明显。HE染色显示LPS刺激引起腺泡腔充血性水肿，白细胞浸润；然而，DEX和ECG处理明显减轻了LPS诱导的乳腺组织病理变化（图2A、2B）。MPO检测也证实，ECG处理可极显著降低LPS诱导的炎症细胞浸润（Plt;0.0 图3A）。进一步分析了ECG对小鼠乳腺组织中促炎细胞因子和氧化应激细胞因子表达的影响。与对照组相比，LPS诱导的MAC-T细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的蛋白水平极显著增加（Plt;0.01）；但是，ECG处理后这些细胞因子的表达呈剂量依赖性而且极显著降低（Plt;0.01），其中40 μg·kg^-1 ECG处理组的MPO活性和IL-1β、COX-2的表达极显著低于DEX处理组（Plt;0.0 图3B～F）。

2.2 ECG对NF-κB炎性通路的调控

采用Western blot检测NF-κB两个关键亚基（p65和IκB）的蛋白和磷酸化水平。在MAC-T细胞（图4A～C），p65和IκB的蛋白水平在不同处理之间没有显著差异（Pgt;0.05）；LPS处理的细胞中p-p65和p-IκB 蛋白水平较对照组极显著增加（Plt;0.01）；在ECG（1、15 和 30 μg·mL^-1）处理的细胞中，p-p65和p-IκB蛋白水平极显著下降（Plt;0.01）。同样，ECG（10、20、40 mg·mL^-1）极显著降低小鼠乳腺组织中p-p65和p-IκB蛋白水平（Plt;0.0 图4D～F）。在15和30 μg·mL^-1 ECG处理组的MAC-T细胞和20、40 mg·mL^-1 ECG处理的乳腺组织中，p-p65和p-IκB蛋白水平极显著低于DEX处理组（Plt;0.01）。

采用免疫荧光分析了MAC-T细胞中p65的核移位（图5A）。结果表明，LPS增强了细胞核p65的荧光信号，而ECG减弱了细胞核p65的信号。MAC-T细胞核p65含量分析也显示，LPS处理导致核中p65水平极显著高于对照组（Plt;0.01），ECG剂量依赖性地降低了细胞核p65含量（Plt;0.0 图5B）。

2.3 ECG对MAC-T细胞和小鼠乳腺焦亡的抑制效应

采用Annexin V-FITC/PI方法检测各处理组细胞膜破裂情况。与空白对照组相比，LPS组被PI标记的红色细胞数目增多；但是ECG处理组的红色细胞数目较LPS组明显降低（图6A）。荧光定量分析也表明，ECG各处理组细胞破裂程度均较LPS组极显著地降低（Plt;0.01），且具有剂量依赖性（图6B）。

其次，通过检测细胞焦亡特异指标ROS、LDH和IL-18的表达水平，以进一步证明ECG对LPS诱导的MAC-T细胞焦亡的抑制作用。与空白对照组相比，LPS组MAC-T细胞和小鼠乳腺ROS荧光强度、LDH活性和IL-18水平极显著增强（Plt;0.0 图7）；但是，ECG处理剂量依赖性而且极显著降低了ROS、LDH和IL-18的水平（Plt;0.01）。

2.4 ECG对LPS诱导的NLRP3炎性小体的影响

采用Western blot检测NLRP3炎性小体相关蛋白的表达水平。与空白对照组相比，LPS 组MAC-T细胞中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein， ASC）、caspase-1和GSDMD-N的蛋白水平极显著提高（Plt;0.0 图8）；与 LPS处理相比，ECG剂量依赖性地降低上述蛋白的表达水平（Plt;0.01），而且30 μg·mL^-1 ECG处理组细胞中caspase-1、ASC和GSDMD-N表达量极显著低于DEX处理组（Plt;0.01）。同样，ECG处理剂量依赖性地降低了小鼠乳腺组织中LPS诱导的上述蛋白的表达水平，且caspase-1、ASC和GSDMD-N表达量极显著低于DEX处理组（Plt;0.0 图9）。

3 讨 论

作者和其他前期研究报道，1 μg·mL^-1 LPS通过NF-κB和MAPK通路触发MAC-T细胞的炎性反应^［3-4］，并且通过NLRP3焦亡小体抑制细胞焦亡反应^［7］。另一方面，DEX是一种广泛用于治疗各种急性和慢性炎症性疾病的药物，该药物对LPS诱导的炎症反应的抑制作用已在小鼠等动物模型中得到广泛的证实^［3，21］。本研究发现，ECG在≤30 μg·mL^-1的浓度下对MAC-T细胞活性没有影响，表明对细胞无毒性（图1A）。基于上述这些数据，并且Esmaeelpanah等^［22］发现10、20和30 mg·kg^-1ECG对丙烯酰胺引起的大鼠神经毒性具有抑制效应，本研究利用LPS刺激MAC-T细胞和小鼠乳腺，并且设计空白对照组、LPS组、LPS + DEX组和LPS + ECG组。通过比较LPS组与空白对照组以揭示LPS诱导的炎性反应，再通过LPS + ECG组与LPS + DEX组、LPS组的比较反映ECG的效应。

很多研究报道炎性因子在乳腺炎发生过程中起着关键作用^［3-5］。ECG为儿茶素多酚成分之一，儿茶素多酚还包括表儿茶素（epicatechin， EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin， EGC）和表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate， EGCG）^［23］。儿茶素的结构为黄烷-3-醇，由两个苯环（A环和B环）通过一个二氢吡喃杂环（C环）相连而成，形成C 6-C 3-C 6的结构通式；ECG、EC、EGC和EGCG结构的差异在于羟基数量不同和C环的4’连接的官能团不同，由于它们结构的相似性，均显示出抗癌、抗炎、抗氧化等方面的重要活性^［23］。特别地，EC和EGCG能够显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞、MAC-T细胞和大鼠模型中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达^{［3，24-26］}。小鼠上的研究进一步揭示了ECG具有抗动脉粥样硬化的作用^{［12，18］}。本研究进一步揭示ECG能有效地抑制MAC-T细胞和小鼠乳腺组织中LPS诱导的炎性因子的表达（图1～3），这与Chen等^［13］的研究结果一致，表明ECG具有抑制乳腺炎症的作用。

氧化应激通过激活NF-κB促进炎性因子的表达，从而诱导炎症的发生^［11］。前期研究报道绿茶儿茶素能够降低肥胖、血压、低密度脂蛋白胆固醇以及心脑血管疾病风险^［11］，其中EGCG降低缺氧BV2细胞中COX-2、iNOS和MPO的表达^［27］。COX-2由组织损伤部位促炎细胞因子（如IL-1和IL-6）刺激释放的诱导酶，它催化花生四烯酸产生前列腺素E2来刺激疼痛和炎症的发生^［28］。iNOS为一氧化氮合酶，被炎性等刺激激活并催化NO的生成，从而促进细胞死亡^［29］。MPO由巨噬细胞和中性粒细胞产生，为氧化应激反应关键的介导因子；MPO活性与中性粒细胞的数量成正比，是中性粒细胞浸润和促炎因子表达的衡量指标^［30］。因此，这些氧化应激指示因子被认为是治疗炎症性疾病和癌症的重要靶点^［29-30］。本研究发现ECG在体内、体外均能抑制LPS诱导的COX-2、iNOS和MPO的活性（图1和3），进一步暗示ECG在牛乳腺炎的治疗中具有抗氧化和抗炎作用。

细胞焦亡分为经典细胞焦亡通路和非经典细胞焦亡通路^［31-33］。相关研究已证明LPS刺激细胞后，由caspase-1、GSDMD和NLRP3炎症小体介导感染细胞发生非经典细胞焦亡^［31-32］。然而，细胞的过度或不当焦亡导致组织损伤^［33］。本研究的体内、体外证据表明ECG对LPS诱导的焦亡与NLRP3炎性小体及其相关蛋白水平的的抑制作用（图6～9）。虽然目前还没有文献报道ECG在细胞焦亡调控中的作用，但是前期的研究也表明，EC和EGCG在小鼠肺炎组织、小鼠骨髓来源的巨噬细胞和慢性阻塞性肺病患者中阻止NLRP3炎症小体和caspase-1的激活^［34-36］；ECG能够减轻大鼠的炎症和凋亡^［14］，这些研究报道进一步证实了ECG的抗焦亡作用。

NF-κB是各种生物细胞中广泛存在的转录因子，是LPS诱导炎症发生的经典信号传导通路^［37-38］。NF-κB在未受到刺激的静息状态下与IκB结合而失活；当LPS等外部刺激出现时，会导致IκB的磷酸化和随后的泛素化降解，释放p65进入到细胞核启动NLRP3、IL-1β和IL-18等靶基因的转录^［37-38］。本研究体内和体外结果表明，ECG降低了LPS诱导的p-IκBα和p-p65蛋白水平与细胞核含量（图4、5）。前期的研究进一步报道ECG抑制ROS、p-IκB、p-p65和TLR4水平^{［13，18］}；EC能够降低p-IκB和p-p65水平^［3］。这些证据充分证明ECG对NF-κB信号通路的抑制作用。

4 结 论

本研究揭示了ECG可有效减轻LPS诱导的MAC-T细胞和小鼠乳腺炎症；ECG抑制了MAC-T细胞和小鼠乳腺组织中LPS诱导的炎性和细胞焦亡反应，并且抑制NF-κB通路以及NLRP3炎症小体及其相关蛋白的表达。今后将进一步研究ECG在抗牛乳腺炎更深层次的分子机制以及在奶牛乳腺炎防治中的应用。

参考文献（References）：

［1］ HU H H， FANG Z， MU T， et al. Application of metabolomics in diagnosis of cow mastitis：a review［J］. Front Vet Sci， 202 8：747519.

［2］ YU S， LIU X， YU D， et al. Morin protects LPS-induced mastitis via inhibiting NLRP3 inflammasome and NF-κB signaling pathways［J］. Inflammation， 2020， 43（4）：1293-1303.

［3］ MA X， LI M M， LU G C， et al. Anti-inflammation of epicatechin mediated by TMEM35A and TMPO in bovine mammary epithelial cell line cells and mouse mammary gland［J］. J Dairy Sci， 202 104（12）：12925-12938.

［4］ LI M M， LU G C， MA X， et al. Anti-inflammation of isoliquiritigenin via the inhibition of NF-κB and MAPK in LPS-stimulated MAC-T cells［J］. BMC Vet Res， 2022， 18（1）：320.

［5］ LI L， WEI X F， YANG Z Y， et al. Alleviative effect of poly-β-hydroxybutyrate on lipopolysaccharide-induced oxidative stress， inflammation and cell apoptosis in Cyprinus carpio［J］. Int J Biol Macromol， 2023， 253：126784.

［6］ MIAO E A， LEAF I A， TREUTING P M， et al. Caspase-1-induced pyroptosis is an innate immune effector mechanism against intracellular bacteria［J］. Nat Immunol， 2010， 11（12）：1136-1142.

［7］ JIANG A M， ZHANG Y， ZHANG X， et al. Morin alleviates LPS-induced mastitis by inhibiting the PI3K/AKT， MAPK， NF-κB and NLRP3 signaling pathway and protecting the integrity of blood-milk barrier［J］. Int Immunopharmacol， 2020， 78：105972.

［8］ RUSSO H M， RATHKEY J， BOYD-TRESSLER A， et al. Active caspase-1 induces plasma membrane pores that precede pyroptotic lysis and are blocked by lanthanides［J］. J Immunol， 2016， 197（4）：1353-1367.

［9］ YE Z， LI L Z， LI Y Z， et al. Tou Nong powder obstructs ulcerative colitis through the regulation of NF-κB/NLRP3/Caspase-1/GSDMD inflammasome pyroptotic pathway［J］. J Ethnopharmacol， 2023， 317：116846.

［10］ SAMPATH C， RASHID M R， SANG S M， et al. Green tea epigallocatechin 3-gallate alleviates hyperglycemia and reduces advanced glycation end products via nrf2 pathway in mice with high fat diet-induced obesity［J］. Biomed Pharmacother， 2017， 87：73-81.

［11］ PREZ-TORRES I， CASTREJ N-TLLEZ V， SOTO M E， et al. Oxidative stress， plant natural antioxidants， and obesity［J］. Int J Mol Sci.， 202 22（4）：1786.

［12］ AL-SAYED E， ABDEL-DAIM M M. Analgesic and anti-inflammatory activities of epicatechin gallate from Bauhinia hookeri［J］. Drug Dev Res， 2018， 79（4）：157-164.

［13］ CHEN G J， CHENG K， NIU Y， et al. （-）-Epicatechin gallate prevents inflammatory response in hypoxia-activated microglia and cerebral edema by inhibiting NF-κB signaling［J］. Arch Biochem Biophys， 2022， 729：109393.

［14］ MALIK S， SUCHAL K， BHATIA J.， et al. Molecular mechanisms underlying attenuation of cisplatin-induced acute kidney injury by epicatechin gallate［J］. Lab Invest， 2016， 96（8）：853-861.

［15］ STADLBAUER S， STEINBORN C， KLEMD A， et al. Impact of green tea catechin ECG and its synthesized fluorinated analogue on prostate cancer cells and stimulated immunocompetent cells［J］. Planta Med， 2018， 84（11）：813-819.

［16］ ZHU M， FEI X Y， GONG D M， et al. Effects of processing conditions and simulated digestion in vitro on the antioxidant activity， inhibition of xanthine oxidase and bioaccessibility of epicatechin gallate［J］. Foods， 2023， 12（14）：2807.

［17］ EZHIL I， LAKSHMI T. Antibacterial efficacy of epicatechin and rutin from Acacia catechu leaf extract against Enterococcus faecalis and Streptococcus mutans-an in vitro study［J］. J Adv Pharm Educ Res， 2017， 7（1）：22-24.

［18］ YU J J， LI W F， XIAO X， et al. （-）-Epicatechin gallate blocks the development of atherosclerosis by regulating oxidative stress in vivo and in vitro［J］. Food Funct， 202 12（18）：8715-8727.

［19］ LI W F， YU J J， XIAO X， et al. The inhibitory effect of （-）-epicatechin gallate on the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells weakens and stabilizes atherosclerosis［J］. Eur J Pharmacol， 202 891：173761.

［20］ SADEK K， SALEH E， AYOUB M. Selective， reliable blood and milk bio-markers for diagnosing clinical and subclinical bovine mastitis［J］. Trop Anim Health Prod， 2017， 49（2）：431-437.

［21］ AL-HARBI N O， IMAM F， AL-HARBI M M， et al. Dexamethasone attenuates LPS-induced acute lung injury through inhibition of NF-κB， COX-2， and pro-inflammatory mediators［J］. Immunol Invest， 2016， 45（4）：349-369.

［22］ ESMAEELPANAH E， RAZAVI B M， HASANI F V， et al. Evaluation of epigallocatechin gallate and epicatechin gallate effects on acrylamide-induced neurotoxicity in rats and cytotoxicity in PC 12 cells［J］. Drug Chem Toxicol， 2018， 41（4）：441-448.

［23］ MUSIAL C， KUBAN-JANKOWSKA A， GORSKA-PONIKOWSKA M. Beneficial properties of green tea catechins［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（5）：1744.

［24］ ZHONG Y， CHIOU Y S， PAN M H， et al. Anti-inflammatory activity of lipophilic epigallocatechin gallate （EGCG） derivatives in LPS-stimulated murine macrophages［J］. Food Chem， 2012， 134（2）：742-748.

［25］ PRINCE P D， FISCHERMAN L， TOBLLI J E， et al. LPS-induced renal inflammation is prevented by （-）-epicatechin in rats［J］. Redox Biol， 2017， 11：342-349.

［26］ YANG D J， LIU S C， CHEN Y C， et al. Three pathways assess anti-inflammatory response of epicatechin with lipopolysaccharide-mediated macrophage RAW264. 7 Cells［J］. J Food Biochem， 2015， 39（3）：334-343.

［27］ KIM S R， SEONG K J， KIM W J， et al. Epigallocatechin gallate protects against hypoxia-induced inflammation in microglia via NF-κB suppression and Nrf-2/HO-1 activation［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（7）：4004.

［28］ LEE J A， HA S， CHO E， et al. Resveratrol as a bioenhancer to improve anti-inflammatory activities of apigenin［J］. Nutrients， 2015， 7（11）：9650-9661.

［29］ NICHOLAS C， BATRA S， VARGO M A， et al. Apigenin blocks lipopolysaccharide-induced lethality in vivo and proinflammatory cytokines expression by inactivating NF-κB through the suppression of p65 phosphorylation［J］. J Immunol， 2007， 179（10）：7121-7127.

［30］ ZHANG Z M， LI L， HUANG G X， et al. Embelia Laeta aqueous extract suppresses acute inflammation via decreasing COX-2/iNOS expression and inhibiting NF-κB pathway［J］. J Ethnopharmacol， 202 281：114575.

［31］ YE J Z， ZENG B， ZHONG M Y， et al. Scutellarin inhibits caspase-11 activation and pyroptosis in macrophages via regulating PKA signaling［J］. Acta Pharm Sin B， 202 11（1）：112-126.

［32］ WU Q R， YANG H， ZHANG H D， et al. IP3R2-mediated Ca²⁺ release promotes LPS-induced cardiomyocyte pyroptosis via the activation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway［J］. Cell Death Discov， 2024， 10（1）：91.

［33］ CHURCHILL M J， MITCHELL P S， RAUCH I. Epithelial pyroptosis in host defense［J］. J Mol Biol， 2022， 434（4）：167278.

［34］ SUHAIL M， REHAN M， TARIQUE M， et al. Targeting a transcription factor NF-κB by green tea catechins using in silico and in vitro studies in pancreatic cancer［J］. Front Nutr， 2023， 9：1078642.

［35］ TIAN X， XUE Y S， XIE G G， et al. （-）-Epicatechin ameliorates cigarette smoke-induced lung inflammation via inhibiting ROS/NLRP3 inflammasome pathway in rats with COPD［J］. Toxicol Appl Pharmacol， 202 429：115674.

［36］ ZHANG C， LI X， HU X， et al. Epigallocatechin-3-gallate prevents inflammation and diabetes-induced glucose tolerance through inhibition of NLRP3 inflammasome activation［J］. Int Immunopharmacol， 202 93：107412.

［37］ ZHANG Q， LENARDO M J， BALTIMORE D. 30 years of NF-κB：a blossoming of relevance to human pathobiology［J］. Cell， 2017， 168（1-2）：37-57.

［38］ TANIGUCHI K， KARIN M. NF-κB， inflammation， immunity and cancer： coming of age［J］. Nat Rev Immunol， 2018， 18（5）：309-324.

（编辑 白永平）