利用孟德尔随机化分析日间过度思睡人群肠道菌群特点

[摘要]"目的"探讨日间过度思睡（excessive"daytime"sleepiness，EDS）人群的肠道菌群变化特点。方法"利用全基因组关联分析（genome-wide"association"study，GWAS）数据进行两样本孟德尔随机化分析，将肠道菌群作为暴露因素，EDS作为结局因素，以单核苷酸多态性（single"nucleotide"polymorphism，SNP）作为工具变量，使用多种方法筛查EDS的潜在致病肠道微生物。通过使用不同的敏感度分析，确保孟德尔随机化分析结果的稳健性。结果"综合多重分析结果，发现丁酸单胞菌、消化球菌、嗜胆菌、厌氧菌、瘤胃球菌和粪球菌在EDS人群中的丰度相对较高，而颤螺旋菌和脱硫弧菌的丰度相对较低。结论"EDS人群存在肠道菌群失调，通过改变饮食结构、使用益生菌等措施调整肠道菌群结构是否可改善EDS有待于今后进一步研究证实。

[关键词]"日间过度思睡；肠道菌群；脑-肠轴；单核苷酸多态性；孟德尔随机化

[中图分类号]"R766""""""[文献标识码]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.31.007

Identification"of"links"between"excessive"daytime"sleepiness"and"gut"microbiota"using"Mendelian"randomization"analysis

ZHANG"Hong1，"HUA"Lin2

1.Department"of"Otolaryngology"Head"and"Neck"Surgery，"Beijing"Tsinghua"Changgung"Hospital"Affiliated"to"Tsinghua"University，"School"of"Clinical"Medicine，"Tsinghua"University，nbsp;Beijing"102218，"China;"2.School"of"Biomedical"Engineering，"Capital"Medical"University，"Beijing"100069，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"changes"of"gut"microbiota"in"excessive"daytime"sleepiness"（EDS）."Methods"Two-sample"Mendelian"randomization"（MR）"analysis"was"performed"using"genome-wide"association"study"（GWAS）"data，"with"gut"microbiota"as"an"exposure"factor，"EDS"as"an"outcome"factor，"and"single"nucleotide"polymorphism"（SNP）"as"an"instrumental"variable，"and"a"variety"of"methods"were"used"to"screen"potential"pathogenic"gut"microbes"for"EDS."The"robustness"of"the"results"of"MR"analysis"was"ensured"by"using"different"sensitivity"analyses."Results"Based"on"the"results"of"the"multiple"analyses，"abundances"of"Butyricimonas，"Peptococcus，"Bilophila，"Anaerofilum，"Ruminococcus"gnavus"and"Coprococcus"were"higher"in"EDS"population，"while"abundances"of"Oscillospira"and"Desulfovibrio"were"relatively"lower."Conclusion"There"was"an"imbalance"of"gut"microbiota"in"EDS"people，"and"whether"adjusting"gut"microbiota"structure"by"changing"diet"structure"and"using"probiotics"can"improve"EDS"remains"to"be"confirmed"by"further"studies"in"the"future.

[Key"words]"Excessive"daytime"sleepiness;"Gut"microbiota;"Brain-gut"axis;"Single"nucleotide"polymorphism;"Mendelian"randomization

日间过度思睡（excessive"daytime"sleepiness，EDS）是指在白天主要清醒时段不能保持清醒和警觉，出现难以克制的困倦欲睡或非预期地进入瞌睡和睡眠状态[1]。研究证实EDS是心血管疾病和神经退行性疾病的风险因素[2]。约50%的阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive"sleep"apnea，OSA）患者主诉有明显的EDS，但在经过充足睡眠和针对OSA治疗后，仍有部分患者（约6%）存在持续的EDS，其原因尚不清楚[2-4]。肠道菌群是指生活在人类和其他动物消化道中复杂的微生物群落。有学者将定植于人体的数量庞大的微生物群视为后天获得的一个重要“器官”，不仅对人类健康发挥不可替代的作用，也与多种系统疾病有着密切联系[5-7]。肠道菌群与多种睡眠疾病、昼夜节律的关系已得到证实，然而肠道菌群与EDS的关系尚未见相关报道[8-10]。本研究探讨EDS人群肠道菌群的特点，以期为临床提供新思路，现将结果报道如下。

1""资料与方法

1.1""研究对象

肠道微生物菌群的汇总统计数据来自一项大规模的多种族的全基因组关联分析（genome-wide"association"study，GWAS），该研究分析了包含来自25个队列、11个国家的18"340个个体数据，其中大多数为欧洲裔（n=13"266）[11]。通过靶向16S核糖体RNA基因的3个不同可变区域（V4、V3-V4和V1-V2）来描述微生物组成。微生物数量性状的定位分析用于识别宿主遗传变异，宿主遗传变异通常被映射到与肠道微生物菌群丰度相关的遗传位点。从属水平到门水平，该研究共包括211个细菌分群，含有131个属水平，35个科水平，20个目水平，16个纲水平和9个门水平。在校正性别、年龄等协变量和遗传主成分后，Spearman相关分析用于识别校正协变量后的细菌分群丰度相关的遗传位点。本研究在属水平上分析131种菌群，排除12种未知菌群，最终有119种属水平的菌群进入孟德尔随机化分析。

1.2""工具变量的选取

孟德尔随机化分析以单核苷酸多态性（single"nucleotide"polymorphism，SNP）作为工具变量，肠道菌群的全基因组数据以Plt;5×10-8作为筛选标准，对SNP之间进行连锁不平衡分析，从而保证SNP之间相互独立（在10Mb范围内连锁不平衡r2lt;0.001）。通过计算F值排除弱工具变量，Flt;10的SNP被认为是弱工具变量而被排除[12]。

1.3""孟德尔随机化分析

应用孟德尔随机化分析EDS相关的细菌，采用逆方差加权法、加权中位数法、MR-Egger法、简单模式法和加权模式法。逆方差加权法是孟德尔随机化的常用方法，通过结合每个SNP因果效应的Wald比值估计因果效应[13]。在不存在水平多效性的情况下，逆方差加权法是较理想且偏倚较小的方法。加权中位数法是将所有的SNP按照Wald比值从大到小排序，然后取等于50％的比值进行回归。MR-Egger法考虑截距项的存在，可在水平多效性存在情况下提供没有偏倚的结果，并计算水平多效性。所有方法获得的相关系数，以Plt;0.05表示存在相关性。

1.4""敏感度分析

敏感度分析包括异质性检验和水平多效性检验。由于工具变量的来源数据库为Meta分析后的整合数据库，不是来源于同一GWAS研究队列，需进行异质性分析。采用Cochrane’s"Q法进行异质性检验，Plt;0.05表示存在异质性[14]。采用Egger回归法对工具变量进行水平多效性检验。若Pgt;0.05，表明工具变量不存在水平多效性，从而在孟德尔随机化分析中不考虑多效性对研究结果造成的影响。

2""结果

2.1""与EDS相关的菌群

以119种属水平的肠道菌群作为暴露变量，EDS为结局变量（研究编号ukb-b-5776和ukb-a-15均为欧洲人群）进行孟德尔随机化分析。得到8种与EDS显著相关的细菌（Plt;0.05），见表1。图1为ukb-b-5776研究中粪球菌的线性回归图和森林图。

2.2""敏感度分析

分别对识别的8种细菌进行敏感度分析，包括异质性检验和水平多效性检验。异质性检验显示Pgt;0.05，说明研究不存在异质性。水平多效性检验显示Pgt;0.05，表明工具变量不存在水平多效性，在孟德尔随机化分析中可不考虑多效性对研究结果造成的影响。留一法检验结果显示去除任意一个SNP均不会对结果产生较大影响，表明本研究的孟德尔随机化分析结果稳健，见表2。

3""讨论

本研究通过使用GWAS数据，对来自11个国家的18"340个个体数据进行孟德尔随机化分析，经过多重分析，结果显示在EDS人群中丁酸单胞菌、消化球菌、嗜胆菌、厌氧菌、瘤胃球菌和粪球菌丰度升高，而颤螺旋菌和脱硫弧菌丰度降低，提示EDS人群的肠道菌群结构存在变化。

人类肠道微生物群含有3.8´1013个细菌，以革兰阳性厚壁菌门和放线菌门、革兰阴性拟杆菌门和变形菌门为主，其中革兰阳性厚壁菌门和革兰阴性拟杆菌门占90%以上。这些种类复杂的肠道细菌在肠道内组成一个庞大而复杂的微生态系统，直接或间接参与宿主的消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、肿瘤发生发展、疾病的发生与转归等诸多方面。包括环境、药物摄入、生活方式、压力等在内的多种因素均可破坏肠道微生物群的平衡并影响其多样性和功能[15]。

丁酸单胞菌主要产生短链脂肪酸，具有免疫抑制作用[16]。丁酸单胞菌被认为是对癌症治疗有害的细菌，与癌症治疗的不良反应有关"[17]。另有研究发现丁酸单胞菌与过敏性哮喘之间存在因果关系，可能参与机体的免疫反应[18]。瘤胃球菌属于革兰阳性菌，是最早发现的胃部细菌之一，在新陈代谢中发挥重要作用，包括有益菌和有害菌。部分瘤胃球菌属被证实具有促炎作用。以肉食为基础的饮食会增加有害菌，减少有益菌的丰度[19]。粪球菌属于革兰阳性菌，是肠道重要的有益菌，起到分解食物、促进养分吸收的作用。如果肠道内部环境发生改变，身体抵抗力下降，粪球菌可损伤肠道黏膜，也会成为致病菌。对颤螺旋菌在肠道中的生态作用或生理特性知之甚少，其在炎症性疾病中的丰度下降[20]。本研究中EDS人群具有丁酸单胞菌、瘤胃球菌和粪球菌丰度增加而颤螺旋菌丰度下降的特点，提示肠道内环境改变。

肠道菌群与EDS的作用途径主要通过脑-肠轴实现。肠道菌群与胃肠道和大脑之间存在着一条复杂的双向通信路径，称为脑-肠轴。神经、内分泌和免疫信号影响肠道和大脑之间的交流，肠道菌群参与这些信号通路的调节，被认为是脑-肠轴的组成部分[21]。Gareau等[22]首次证实肠道感染可导致应激性记忆缺陷，并伴有海马中的脑源性神经营养因子表达降低，即使在细菌清除和肠道病理消除后，记忆障碍仍然存在。Li等[23]研究表明饮食引起的肠道细菌变化与认知功能变化有着时间上的关联，表明微生物和大脑之间有着密切的联系。

孟德尔随机化分析是一种用于检查暴露和复杂结果之间是否存在因果关系的常用方法[24]。临床研究中受实验条件及医学伦理等因素的限制，无法在大样本人群中多次获取样本，利用孟德尔随机化分析及大样本数据库研究有一定的优点。首先，孟德尔随机化分析不易受到反向因果关系和混杂因素的影响；其次，将大量的GWAS样本数据、两组独立的工具变量和不同的方法应用与因果关联评估，避免混杂因素的影响，可进行较准确的因果评估。本研究使用最新GWAS数据库对肠道微生物群与EDS进行孟德尔随机化分析，大大降低混杂因素的影响。

受数据来源的影响，本研究有一定的局限性，如受试者主要为欧洲裔，与国人的饮食习惯、饮食结构、自然环境和人种等存在差异，对结果的影响有待阐明；数据库中是否有重复病例尚未可知。但本研究发现EDS人群的肠道菌群存在一定结构和丰度的变化，可为今后深入研究肠道菌群与EDS关联及EDS改善方法提供一定的研究思路和研究基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024–07–10）

（修回日期：2024–10–09）